頂空-氣相色譜-四極桿質譜結合保留指數法測 定普洱茶香氣成分

申明月，劉玲玲，聶少平*，謝建華，李 昌，毛雪金，王遠興，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

頂空-氣相色譜-四極桿質譜結合保留指數法測 定普洱茶香氣成分

申明月，劉玲玲，聶少平*，謝建華，李 昌，毛雪金，王遠興，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

采用靜態頂空-氣相色譜-四極桿質譜技術對普洱茶的香氣成分進行分析，在利用NIST質譜檢索庫檢索的基礎上，結合保留指數對化合物進行定性，共鑒定出30 種香氣成分，同時運用峰面積歸一化法測得各香氣組分的相對含量。結果表明：所測普洱茶香氣成分主要包括醇類、醛類、酮類、酯類和烴類5類物質，其中醇類化合物和酯類化合物的含量最高，分別占總香氣物質成分的47.73%和40.97%。樣品中含量較高的6個化合物相對標準偏差在4.11%～6.59%之間，本法可為普洱茶香氣成分的分析提供參考。

普洱茶；香氣成分；保留指數；頂空分析；氣相色譜-質譜聯用技術

普洱茶是云南省特有的地方名茶，研究發現其具有降血脂、減肥、抗動脈硬化、防癌、抗氧化、防輻射等多種功效[1]。普洱茶是以地理標志保護范圍內的云南大葉種鮮葉為原料，經殺青、揉捻、日曬等工序制成曬青毛茶，再經渥堆、陳化及干燥等工序加工而成[2]。普洱茶按發酵工藝可分為生普和熟普2 個系列，型制上又可分為散茶和緊壓茶2 類[3]。普洱茶的香氣成分與普洱茶的品質密切相關，也是目前市場上決定普洱茶價格的重要因子[4]。因此，普洱茶特征香氣成分的研究，一直是普洱茶研究工作者長期關注和研究的熱點。

目前普洱茶的香氣成分定性分析主要采用氣相色譜-質譜法，將各色譜峰對應的質譜圖利用譜庫檢索，匹配度越高，定性的可靠性越高[4-5]。然而在實際的樣品分析過程中，會發現普洱茶的香氣成分往往含有多種同分異構化合物，因結構相似，質譜圖差別也不大，采用常規質譜檢索方法不易準確定性，需要結合其他定性方法進行鑒定。1958年Kovats首次提出保留指數（retention index，R I）的概念[6-7]；在Kovats方程中，保留指數以正構烷烴同系物作為參考標準，所有與色譜保留行為有關的流體動力學參數在Kovats方程中被消去。所以，保留指數與色譜分析的許多參數和條件無關，能在定性中減少甚至消除具體實驗條件（如色譜柱、溫度、升溫條件、壓 力等）的干擾，具有很好的準確度和重現性[6-7]。

本實驗采用靜態頂空-氣相色譜-四極桿質譜（headspace-gas chromatography-m ass spectrometry，HSGC-MS）技術對普洱茶的香氣成分進行分析，在利用NIST質譜檢索庫檢索的基礎上，結合保留指數對化合物進行定性，并利用峰面積歸 一化法計算得到普洱茶各香氣成分的相對含量，結果顯示該定性分析策略和香氣成分檢測方法具有較大的優越性，可為普洱茶香氣成分的分析提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

供試茶樣為昆明七彩云南慶灃祥茶葉股份有限公司生產的云南普洱茶（茉莉大葉曬青茶，緊壓茶），將普洱茶樣品按GB/T 8303—2002《茶：磨碎試樣的制備及其干物質含量測定》的要求粉碎，稱取5.00 g茶樣于20 mL頂空進樣瓶中，壓緊瓶蓋，進行HS-GC-MS檢測。正構烷烴（C6～C10、C10～C20） 美國AccuStandard公司。

1.2 儀器與設備

7890A-7000B三重串聯四極桿氣相色譜-質譜聯用儀（配有Agilent G1888A自動頂空進樣器、Masshunter工作站（Version B.03.01）工作站） 美國Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-GC-MS 分析條件

頂空條件[8]：進樣環體積1 mL，樣品瓶加壓壓力10 psi，加壓時間0.5 min，充氣時間0.5 min，進樣時間1 min，進樣環溫度110 ℃，傳輸線溫度130 ℃，樣品瓶的平衡溫度和平衡時間分別在60～100 ℃和15～40 min之間進行優化。

GC條件[9]：進樣口溫度：250 ℃；分流比：1∶1；色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）毛細管色譜柱；升溫程序：起始溫度50 ℃，停留2 min，以3 ℃/min的速率升至200 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣（純度≥99.999%），載氣流速：1 mL/min（恒流模式）。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子電離能量：70 eV；離子源、四極桿與傳輸線溫度分別為230、150、250 ℃；溶劑延遲：3 min；質量掃描方式為全掃描，質量掃描范圍m/z 40～500；質譜數據運用NIST 2008（Version 2.0 f）質譜數據庫進行圖譜檢索。

1.3.2 普洱茶香氣成分保留指數的測定

單一線性程序升溫的條件下保留指數計算公式[6-7]：RI=100n＋100(TRx-TRn)/(TRn+1-TRn)；RI為待測組分的保留指數；TRx為待測組分的 保留時間；n 和n＋1分別表示正構烷烴的碳原子數；TRn＜TRx＜TRn+1。

2 結果與分析

2.1 頂空平衡條件的優化

將密封好的頂空瓶置于頂空進樣器內，分別設置樣品瓶的平衡溫度為60、70、80、90、100 ℃，平衡30 min后進行測定。從圖1可看出，平衡溫度越高，普洱茶樣品釋放出來的香氣組分的數量與豐度都隨之增多，而當平衡溫度高于90 ℃時測得的香氣組分的數量與豐度趨于穩定。為避免普洱茶樣品加熱過度使一些性質不穩定的香氣組分發生熱分解、氧化等反應從而產生新的成分，選擇頂空的平衡溫度為90 ℃。此外，在平衡溫度90 ℃的條件下，將頂空瓶密封好后分別平衡15、20、25、30、35、40 min，從圖2可以看出，當平衡時間達到30 min后，測定結果趨于穩定，因此選擇樣品的平衡時間為30 min。

圖1 頂空分析中樣品平衡溫度對主要香氣成分的影響Fig.1 Effect of headspace heating temperature on peak area of aroma components

圖2 頂空分析中樣品平衡時間對主要香氣成分的影響Fig.2 Effect of headspace heating time on peak area of aroma components

2.2 分析方法的精密度

6次平行測定普洱茶樣品中含量較高的6 個化合物的相對標準偏差分別為：4.11%（芳樟醇）、5.39%（乙酸芐酯）、5.04%（己烯醇）、6.59%（乙酸葉醇酯）、6.27%（苯甲酸甲酯）、4.98%（6-莰烯酮）。化合物含量的相對標準偏差均小于10%，符合方法的要求。

2.3 普洱茶香氣成分檢測結果

根據NIST 2008質譜圖庫檢索結果，結合保留指數文獻值[10-26]對普洱茶香氣成分進行了鑒定， 共得到30種化合物，同時運用峰面積歸一化法測得各香氣組分的相對百分含量，結果詳見表1。由鑒定結果可知，普洱茶香氣成分十分復雜，并且相對含量差別也很大。通過比較分析普洱茶香氣成分，可以看出它們主要包括醇類、醛類、酮類、酯類和烴類5 類物質，其中醇類化合物有4 種，相對含量為47.73%；酯類化合物有6 種，相對含量為40.97%；酮類化合物有2 種，相對含量為6.23%；烴類化合物有16 種，相對含量為4.77%。在16種烴類化合物中大部分都是單萜烯類和倍半萜烯類物質，其中單萜烯類物質有4 種，相對含量為2.29%；倍半萜烯類物質有9 種，相對含量為1.39%。普洱茶所含香氣組分相對含量超過3%的組分有6 種，依次為芳樟醇（36.71%）、乙酸芐酯（23.40%）、己烯醇（10.67%）、乙酸葉醇酯（7.96%）、苯甲酸甲酯（4.64%）、6-莰烯酮（3.99%）。

表 1 普洱茶香氣成分定性分析結果Table 1 Aroma components identified from Pu-erh tea

注：RI.通過文獻保留指數與實測保留指數比對定性；MS. 通過NIST質譜庫檢索定性；RIexp.實測保留指數值；RIlit.文獻保留指數值。

3 結 論

普洱茶香 氣成分中含有多組同分異構體，分子式為C10H16的組分有4 個（均為單萜烯），分子式為C15H24的組分有9個（均為倍半萜烯）。由于結構相似，其在 NIST質譜數據庫中的圖譜非常相似，因此僅依靠譜庫檢索結果來定性有可能會出現錯誤的鑒定結果。如圖3所示，峰8、9具有幾乎相同的質譜圖，且譜圖直接檢索的結果皆為3-蒈烯；參考保留指數文獻值[17]可發現，3-蒈烯的保留指數為1 010，而峰8、9的保留指數分別為1 050和1 059，這說明譜圖直接檢索的結果是不可靠的。此時將峰8、9的保留指數值與文獻[16-18]對比就很容易確定兩峰所對應的化合物，即峰8應為反式-β-羅勒烯，峰9應為萜品烯。

圖3 峰8（A）與峰9（B）電子電離質譜圖Fig.3 Mass spectra of Peak 8 (A) and Peak 9 (B)

采用保留指數結合NIST質譜譜庫檢索對普洱茶香氣成分進行了定性分析，共鑒定出30 種香氣成分，主要包括醇類、醛類、酮類、酯類和烴類5 類物質，同時運用峰面積歸一化法測得各香氣組分的相對百分含量。實驗結果表明靜態頂空-氣相色譜-保留指數-質譜分析是一種快速有效分析普洱茶香氣成分的方法，該分析策略彌補了常規GC-MS譜庫檢索定性方法的不足，大大提高了定性分析的準確性和效率，使定性結果更加可靠。該定性分析思路應用在其他復雜樣品揮發性成分檢測中也擁有巨大的潛力和獨特的優勢，值得進一步研究推廣。

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Analysis of Aroma Components from Pu-erh Tea by Headspace-GC-MS Based on Retention Index

SHEN Ming-yue, LIU Ling-ling, NIE Shao-ping*, XIE Jian-hua, LI Chang, MAO Xue-jin, WANG Yuan-xing, XIE M ing-yong (State Key Laboratory of Food Science and Techonology, Nangchang University, Nangchang 330047, China)

A static headspace-gas chromatography-mass spectrometry (HS-GC-MS) method was used to analyze aroma components from Pu-erh tea. The separated peaks were identified by mass spectral library searching combined with retention index comparison. Thirty aroma components were identified from Pu-erh tea, mainly including alco hols (47.73%) and esters (40.97%). The precision expressed as relative standard deriva tion (RSD, n = 6) of the proposed method was in the range of 4.11%–6.59%. This method can be widely applied for the qualitative analysis of aroma components from Pu-erh tea.

Pu-erh tea; aroma components; retention index; headspace analysis; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

O656.2

A

1002-6630（2014）06-0103-04

10.7506/spkx1002-6630-201 406021

2013-10-12

教育部“新世紀優秀人才支持計劃”項目（NCET-12-0749）；江西省 高等學校科技落地計劃項目（產學研合作）（KJLD13004）

申明月（1984—），女，博士研究生，研究方向為食品化學與分析技術。E-mail：shenmingyue1107@163.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與分析、食品營養與安全、糖化學與糖生物學。E-mail：spnie@ncu.edu.cn