氣相色譜-質譜聯用法測定香腸中3種單甘油酯

賈海濤，馬育松，陳瑞春

（河北出入境檢驗檢疫局，河北 石家莊 050051）

氣相色譜-質譜聯用法測定香腸中3種單甘油酯

賈海濤，馬育松，陳瑞春

（河北出入境檢驗檢疫局，河北 石家莊 050051）

建立一種氣相色譜-質譜聯用檢測香腸中3種單甘油酯含量的方法。3種單甘油酯分別為單辛酸甘油酯、單癸酸甘油酯和單月桂酸甘油脂。樣品以二氯甲烷-正己烷（1∶1）提取，提取液經濃縮后，經凝膠滲透色譜凈化，氣相色譜-質譜聯用檢測和確證，外標法定量。本方法測定低限為50 mg/kg。3種單甘油酯在20～1 000 μg/mL范圍呈良好線性，線性相關系數不小于0.999 6。回收率范圍在81.3%～105%，測定結果的相對標準偏差（n=8）為3.64%～8.56%。該方法具有快速、簡便、準確度高、精密度高的特點，適用于香腸中3種單甘油酯的測定。

氣相色譜-質譜聯用；香腸； 單甘油酯

單甘油酯就是甘油分子中的3個羥基之一與有機酸脫水縮合成的單酯化合物，由于它具有一個親油的長鏈烷基和兩個親水的羥基，因而具有很好地親油親水能力，被廣泛應用于食品工業中。在食品工業中，單脂肪酸甘油酯主要作為乳化劑和穩定劑使用，其用量占食品乳化劑總用量的70%左右，添加在食品中可起到乳化、起酥、膨松和保鮮的作用。可用于糕點、飲料、肉制品等食品中[1]。單辛酸甘油酯、單癸酸甘油酯和單月桂酸甘油酯是目前在食品中使用比較廣泛的3種單甘油酯。單辛酸甘油酯是一種新型無毒高效廣譜防腐劑，它在人體內和脂肪一樣，能分解代謝，無任何積蓄和不良反應。單月桂酸甘油酯是一種親酯性的非離子型表面活性劑，天然存在于母乳和美洲蒲葵中，是一種優良的食品乳化劑，同時又是一種國際公認的安全、高效、廣譜的抑菌劑。單月桂酸甘油酯同時也是一種天然防腐劑，抑菌效果不受酸度大小的影響且抗菌譜廣，對食品中常見細菌均有較強作用，同時還具有抑制多種病毒和原生動物的功效，美國食品與藥物管理局于1977年批準該產品為“一般公認安全”食品添加劑[2-3]。

中國與世界各國和組織對于單甘油酯類的使用都有相關的規定，GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》中規定：單辛酸甘油酯常用作面制品防腐劑，用于豆餡、蛋糕、月餅、濕切面，其最大使用量為1.0 g/kg；用于肉腸為0.5 g/kg；單月桂酸甘油酯作為食品乳化劑可在各類食品中按生產需要適量使用[4]。日本食品添加物公定書第八版中規定單甘油酯類為不需限量使用的食品防腐劑，可應用于所有食品。國際食品法典委員會規定單甘油酯類可應用于各種食品，并且未規定最大使用量。歐盟規定單甘油酯類可在各類食品中使用，最大使用量范圍為5～10 g/kg。

目前尚無單甘油酯檢測的國際標準和國家標準，相關的文獻報道主要是應用氣相色譜法、液相色譜法測定單甘油酯產品的含量[5-25]，而對于食品中單甘油酯的檢測方法文獻報道較少，均是對某一種單甘油酯進行測定并且樣品前處理需甲酯化，操作步驟復雜[12]，這就造成食品檢驗方面的缺陷，產品結論的判定有很大的風險，因此，建立單甘油酯的檢測方法很有意義。本實驗通過凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）技術，優化凈化條件，確立氣相色譜-質譜聯用檢測香腸中3種單甘油酯的方法，也為其他單甘油酯的檢測提供了思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香腸，自制（把豬肉制成肉餡，灌入腸衣中，通風處晾干即得）。

二氯甲烷、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、環己烷（均為色譜純） 美國Dikma公司；正己烷-二氯甲烷（1∶1，V/V，量取50 mL二氯甲烷和50 mL正己烷混合）；乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V，量取50 mL乙酸乙酯和50 mL環己烷混合）；單辛酸甘油酯（CAS：19670-49-6）、單癸酸甘油酯（CAS：26402-22-2）、單月桂酸甘油酯（CAS：142-18-7）標準品（純度均不低于99%）上海安譜公司。

標準溶液配制：分別適量稱取單甘油酯標準品，用丙酮溶解并定容，配制成10 mg/mL的單一標準儲備液，于4 ℃冰箱保存。使用前再根據需要將標準儲備液用正己烷稀釋成適當質量濃度的標準工作液。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀、5975C質譜儀 美國安捷倫公司；PT3100均質器 瑞士Kinematic公司；VORTEX-2 GENE漩渦混合器 美國Scientific Industries公司；KN-70型離心機 日本Kubota公司；MPS凝膠色譜樣品凈化系統 美國J2Scientific公司；LABOROTA 4000旋轉蒸發器 德國Heidolph公司；TurboVap氮氣吹干儀美國Zymark公司；0.22 ?m有機系濾膜。

1.3 方法

1.3.1 提取

稱取試樣2 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入15 mL正己烷-二氯甲烷（1∶1），10 000 r/min均質提取2 min，再超聲提取10 min，4 000 r/min離心10 min，將上清液經濾紙過濾至50 mL雞心瓶中。再用10 mL正己烷-二氯甲烷（1∶1，V/V）重新提取殘渣一次，合并提取液于同一雞心瓶中，于40 ℃旋轉蒸發至0.5 mL左右，將濃縮液轉移至10 mL離心管中，用5 mL乙酸乙酯-環己烷（1∶1）分兩次洗滌雞心瓶，合并溶液至上述10 mL離心管中，用乙酸乙酯-環己烷（1∶1）定容至刻度。

1.3.2 凈化

以上溶液用GPC系統按照凈化程序進行凈化，收集的洗脫液于40 ℃旋轉蒸發至溶液體積少于2 mL，溶液轉移至離心管中，用5 mL正己烷分兩次洗滌殘渣，合并溶液至離心管中，于40 ℃氮氣吹干至少于2 mL，正己烷定容至2 mL，經0.22 ?m有機濾膜過濾，供氣相色譜-質譜分析。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：150 ℃保持10 min，以20 ℃min升至280 ℃，保持5 min；進樣口溫度：300 ℃；載氣：氦氣，純度≥99.999%；載氣流速：恒流模式 1 mL/min；進樣方式：不分流；開閥時間：1 min；進樣量：2 μL。

1.3.4 GPC條件

GPC柱：200 mm×22 mm，填料：S-X3 Bio-Beads，粒徑38～75 ?m；流動相：乙酸乙酯-環己烷（1∶1）；流速：4.7 mL/min；進樣量：5 mL；凈化程序：0～8 min棄去洗脫液，8～12.5 min收集洗脫液。

1.3.5 質譜條件

離子源：電子電離；離子源溫度：230 ℃；電離能量：70 eV；接口溫度：300 ℃；掃描方式：選擇離子監測；3種單甘油酯的選擇離子及相對豐度見表1。

表 1 3種單甘油酯的選擇離子及相對豐度Table 1 Selected ions and relative ion intensities for three monoglycerates

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

表 2 提取溶劑的選擇（添加量500 mg/kg）Table 2 Selection of the optimal extraction solvent at the spiked level of 500 mg/kg

3種單甘油酯都溶于乙醇、乙酸乙酯、氯仿及其他氯化烴或苯，本方法選擇乙酸乙酯、乙腈、丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇和正己烷作為提取溶劑進行提取效率實驗。采用自制香腸的方法，在制作香腸時定量加入這3種單甘油酯，添加量為500 mg/kg。結果發現，二氯甲烷對單辛酸甘油酯和單癸酸甘油酯的提取效率最高、正己烷對單月桂酸甘油酯的提取效率最高，所以首先確定用正己烷和二氯甲烷混合溶液作為提取溶劑。然后對兩者的混合比例進行實驗比較，考察正己烷和二氯甲烷體積比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3條件下的提取效果，結果發現當正己烷和二氯甲烷的比例為1∶1時，提取效率最好，結果見表2。

2.2 凈化條件的選擇

提取液用氣相色譜-質譜儀直接測定，其干擾比較明顯。主要是基質中蛋白質和油脂產生的干擾，所以采用GPC進行凈化，經實驗發現，可以較好地去除基質的干擾。GPC又稱為尺寸排阻色譜，它是按溶質分子大小進行分離的一種色譜技術。它可有效去除樣品中脂類、色素、蛋白等大分子干擾物，常用于脂肪含量較高的動物源性食品的凈化。在凈化過程中，采用系統自帶的紫外檢測器結合分段采集分析的方法確定并收集流出物，以確定合適的收集時間段，結果見圖1。結果表明脂類、蛋白及絕大多數色素干擾物在8 min前流出GPC柱，而3種單甘油酯混合物的流出時間為8～12.5 min，所以確定GPC凈化程序為0～8 min棄去洗脫液，8～12.5 min收集洗脫液，盡管仍有部分雜質，但通過氣相色譜的分離，不干擾目標組分的測定。

圖1 3種單甘油酯混合標準溶液（a）和添加3種單甘油酯的香腸提取物（b）的GPPCC色譜圖Fig.1 GPC chromatograms of (a) mixed standard solution of three monoglyceride; (b) extracts of sausage spiked with three monoglycerides

實驗過程中發現，在進行濃縮的過程中，提取液不能吹干，并且濃縮時的溫度也要控制在40℃以下，否則待測組分的回收率很低，考慮原因可能是溶液由于吹干以后再復溶時不能充分溶解，所以在濃縮過程中要控制好濃縮溫度并且防止提取液被吹干。

2.3 氣相色譜條件的選擇

在優化氣相色譜法條件時，根據待測物沸點高，不容易氣化，極性較強的性質，比較DB-5、DB-1301、DB-5MS、INNOWax和FFVP毛細管色譜柱，以較高溫度為起始溫度，兩階升溫程序，發現用DB-5MS毛細管色譜柱時峰形最理想。

2.4 質譜條件的優化

首先利用全掃描采集方式，根據各組分的全掃描質譜圖（圖2）以及背景干擾情況，選擇各組分的定量及定性離子。為減少干擾，提高方法的選擇性和靈敏度，本實驗采用選擇離子監測法，盡量選擇豐度高、高質量端的離子進行定性和定量。根據樣品中各組分的離子種類和各離子的相對豐度，結合保留時間，在不增加前處理步驟的情況下，可以對疑為陽性的樣品進行確證。香腸空白樣品以及測定低限的氣相色譜-質譜圖見圖3。

圖2 單辛酸甘油酯（a）、單癸酸甘油酯（b）和單月桂酸甘油酯（c）的全掃描質譜圖Fig.2 Full scan mass spectra of glycerate mono-caprylin (a), glyceryl monodecanoate (b) and glyceryl monolaurate (c)

圖3 香腸空白樣品（a）以及測定低限（b）的氣相色譜-質譜圖Fig.3 GC-MS profile of sausage blank sample (a) and GC-MS profile for the limit of quantification (b)

2.5 線性范圍及測定低限

將各單甘油酯標準儲備液逐級稀釋為20、50、100、200、500、1 000 μg/mL的系列混合標準工作溶液，在選定的氣相色譜-質譜條件下進樣測定，以被測物峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，得出線性方程和相關系數，3種單甘油酯在20～1 000 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，其相關系數不小于0.999 6。將一定質量濃度標準品添加到自制香腸中，經過前處理和上機檢測分析，當RSN為10時作為分析方法的測定低限實驗方法，實際測定低限為50 mg/kg。3種單甘油酯的線性回歸方程線性、相關系數以及測定低限見表3。

表 3 3種單甘油酯的線性方程、線性相關系數和測定低限Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients and limit of quantification of three monoglycerates

2.6 回收率實驗

表 4 3種單甘油酯的回收率及其精密度的實驗數據（ =8）Table 4 Spiked recoveries and RSD of 3 monoglycerates (n = 8)

本方法在自制香腸中添加3種單甘油酯標準儲備溶液進行回收率實驗，添加水平為50、100、200 mg/kg，按照選定的實驗條件測定，每個水平平行測定8次，結果見表4。結果表明，在以上3個添加水平下，回收率范圍為81.3%～105%，相對標準偏差范圍為3.64%～8.56%，說明建立的該方法能滿足樣品的檢測要求。如果在實際樣品檢測中發現有超出線性范圍的情況，可以將樣品溶液稀釋至線性范圍之內再進行測定。

3 結 論

本方法建立了GPC凈化，氣相色譜-質譜法測定香腸中單辛酸甘油酯、單癸酸甘油酯、單月桂酸甘油酯含量的方法。通過對各項參數的實驗，找出了最佳的提取和凈化方法，使檢測儀器參數達到最優化。在選定的儀器條件下，3種單甘油酯能很好地分離和檢測，方法簡便、結果準確，能滿足樣品的檢測要求。本方法與現有方法相比，檢測單甘油酯的種類多，通過GPC凈化，凈化效果理想，操作過程簡單，定性定量準確，靈敏度高，重現性好，能滿足香腸中3種單甘油酯共同檢測的定量和確證要求，為食品中單甘油酯的檢測提供了思路。

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Determination of Three Monoglycerates in Sausage by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

JIA Hai-tao, MA Yu-song, CHEN Rui-chun
(Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang 050051, China)

A method for the determination of three monoglycerate, mono-glycerate glycerate monocaprylin, glyceryl monodecanoate and glyceryl monolaurate, in sausage by GC-MS was established. Samples were extracted with dichloromethane-n-hexane (1:1), and the extract was concentrated, purified by gel permeation chromatography (GPC), and detected and confirmed by GC-MS. The quantitative analysis was conducted by using an external standard method. The limit of quantification was 50 mg/kg. Satisfactory linearity was observed with a correlation coefficient of no less than 0.999 6 in the concentration range of 20?1 000 μg/mL. Spiked recoveries were in the range of 81.3%?105% with RSD of 3.64%?8.56% (n = 8). The method is rapid, convenient, accurate and precise, which can be applied to determine monoglycerate in sausage.

gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); sausage; monoglycerate

TS207.3

A

1002-6630（2014）06-0094-04

10.7506/spkx1002-6630-201406019

2013-05-06

國家標準化管理委員會資助項目(2009B52)

賈海濤(1978—)，男，工程師，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：ciq_jiahait@sina.com