腸炎沙門氏菌EMA-PCR檢測方法的建立

顏成英，湯曉艷*，王 敏，康大成，李朋穎，鄭 鋅

（1.南京農業大學 教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095；

2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081）

腸炎沙門氏菌EMA-PCR檢測方法的建立

顏成英1,2，湯曉艷2,*，王 敏2，康大成2，李朋穎2，鄭 鋅1,2

（1.南京農業大學 教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095；

2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081）

將熒光染料疊氮溴化乙錠（ethidium monoazide，EMA）與聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測技術相結合，用于腸炎沙門氏菌活菌的檢測。實驗參數優化結果表明，當EMA終質量濃度50 μg/mL、曝光時間10 min時，可以抑制約107CFU/mL腸炎沙門氏菌死菌DNA的擴增；活菌靈敏度檢測結果顯示，EMA-PCR方法檢測限與單一PCR方法一樣均為27.5 CFU/mL，說明EMA處理既不會影響活菌DNA的擴增也不會影響PCR方法的靈敏度。利用EMA-PCR方法檢測死活混合菌液時發現，添加EMA的實驗組DNA條帶亮度會隨著活菌比例的降低而變暗，且當樣品中全是死菌時，沒有目標條帶出現；而不添加EMA的對照組DNA條帶亮度沒有變化，當樣品中全是死菌時，目標條帶依然清晰可見。說明添加EMA可以達到區分死活菌的目的，EMA-PCR方法只檢測樣品中的活菌，避免了死菌DNA造成假陽性的可能性。

疊氮溴乙錠；聚合酶鏈式反應；腸炎沙門氏菌

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）是引起人類腸胃炎的重要致病菌，也是導致禽蛋及其相關產品污染的主要原因[1]。據統計，由腸炎沙門氏菌引起的食物中毒占沙門氏菌食物中毒總數的17%[2]，從患者身上分離出腸炎沙門氏菌血清型的頻率僅次于鼠傷寒沙門氏菌[3]。傳統分離純化法是腸炎沙門氏菌檢測常用方法，該方法雖然準確率高，但過程繁瑣、耗時耗力[4-5]，不能滿足快速檢測的要求。隨著分子生物學和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測技術的發展，多種快速檢測方法[6-7]應運而生并發展成熟，其中針對 各類致病菌特異性基因建立的PCR方法，因靈敏度高、速度快而被廣泛用于目標菌的檢測[8-10]。但是單一PCR檢測技術無法區分樣品中的死菌和活菌[11]，因為死亡菌體的DNA會長時間殘留在環境中[12]，PCR在以活菌DNA為模板進行擴增的同時也會擴增死菌的DNA，而使得檢測值高于樣品中活菌的數量，甚至出現假陽性結果。研究發現熒光染料疊氮溴乙錠（ethidium monoazide，EMA）可以特異性結合游離DNA、死菌DNA和細胞膜不完整或受損細胞的DNA，使其不能發生PCR反應[13]，將EMA與PCR技術聯用可以達到克服傳統PCR無法區分死活菌缺點的目的。EMA-PCR方法已用于多種致病菌的檢測[14-15]，其中EMA濃度[16]及曝光時間[17]是影響死菌DNA擴增抑制效果的關鍵因素，因為EMA濃度過低、曝光時間過短均達不到完全抑制的目的，濃度過高又會對活菌DNA擴增產生影響[18]。本實驗以腸炎沙門氏菌為研究對象，優化抑制腸炎 沙門氏菌死菌DNA擴增的最小EMA質量濃度和最佳曝光時間，分析EMA-PCR方法的靈敏度及驗證EMA區分腸炎沙門氏菌死菌和活菌的效果，以期為將該方法應用于腸炎沙門氏菌檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸炎沙門氏菌 中國醫學細菌保藏管理中心；EMA美國Sigma公司；2×Power Taq PCR Master Mix 北京百泰克生物技術有限公司；DL 2000 DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司。

DEC-810 PCR儀 東勝創新生物科技公司；全能臺式高速冷凍離心機 德國Thermo公司；NanoDrop 2000C紫外-可見分光光度計 美國Thermo Fisher公司；鹵鎢燈（500 W） 飛利浦公司。

1.2 方法

1.2.1 腸炎沙門氏菌活菌和死菌的制備

腸炎沙門氏菌接種LB培養基，37 ℃、200 r/min過夜培養，12 000 r/min離心10 min收集菌體，沉淀用滅菌生理鹽水懸浮，紫外-可見分光光度計調整OD600nm為0.40（菌液濃度為107CFU/mL），得到活菌菌懸液。活菌菌懸液95 ℃水浴加熱30 min得到死菌菌懸液。平板培養活菌菌懸液及死菌菌懸液，分別用于菌落計數和滅活效果檢驗。

1.2.2 抑制腸炎沙門氏菌死菌DNA擴增的最小EMA質量濃度

取0.5 mL滅活菌懸液至離心管中，加入EMA至終質量濃度分別為1、5、10、50、100、200 μg/mL，37 ℃黑暗處放置5 min，然后將離心管開蓋放置冰上，在距離燈管12 cm處曝光5 min，離心收集菌體，試劑盒法提取DNA，DNA提取物定容為500 μL。

1.2.3 抑制腸炎沙門氏菌死菌DNA擴增的最佳曝光時間

取0.5 mL滅活菌懸液至離心管中，加入EMA至終質量濃度為50 μg/mL，37 ℃黑暗處 放置5 min，然后將離心管開蓋放置冰上，在距離燈管12 cm處曝光，曝光時間分別為2、5、10、20 min，DNA提取同上。

1.2.4 EMA-PCR方法檢測靈敏度分析

滅菌生理鹽水梯度稀釋OD600nm為0.40的活菌菌懸液，使菌液濃度為107～101CFU/mL，每個稀釋度取0.5 mL，各取兩管，一管加入EMA（終質量濃度為50 μg/mL、曝光10 min）處理后再提取DNA，一管不做處理直接提取DNA，DNA提取同上。

1.2.5 不同活菌比例的混合菌液的EMA-PCR擴增

分別配制含有100%、75%、50%、20%、10%、5%、3%、1%、0%的腸炎沙門氏菌活細胞的菌懸液，分別取0.5 mL至離心管中，各取兩管，一管加入EMA（終質量濃度分別為50 μg/mL、曝光10 min）處理后再提取DNA，一管不做處理直接提取DNA，DNA提取同上。

1.2.6 引物序列及PCR反應

引物序列為沙門氏菌屬通用引物[19]，引物序列上游：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGG GCAA-3’，下游：5’-TCATCGCACCGTCAAA GGAACC-3’，產物大小為284 bp，引物由上海生工合成。25 μL的擴增體系包括：12.5 μL PCR Master Mix，1.5 μL模板DNA，上下游引物各1.5 μL（8 μmol/L）、8 μL ddH2O。PCR反應體系：95 ℃預變性5 min，35個循環每個循環95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 抑制死菌DNA擴增的EMA質量濃度的確定

圖1 腸炎沙門氏菌EMA-PCR檢測方法中EMA質量濃度的優化Fig.1 Optimization of EMA concentration

活菌菌懸液平板計數結果為2.75×107CFU/mL，死菌菌懸液培養平板無菌落長出，說明滅活較徹底。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1所示，目標條帶大小為284 bp。當菌液濃度為2.75×107CFU/mL時，DNA條帶亮度隨著EMA質量濃度的增大逐漸變暗直至消失，當EMA質量濃度為50 μg/mL時即可完全抑制107CFU/mL死菌的DNA擴增。

2.2 最佳曝光時間的確定

不同曝光時間對EMA抑制腸炎沙門氏菌死菌DNA擴增結果如圖2所示。當菌液濃度為2.75×107CFU/mL時，DNA條帶亮度隨著曝光時間的延長逐漸變暗直至消失，曝光時間為5 min時，條帶基本消失，為了達到完全抑制目的，后續實驗曝光時間設為10 min。

圖2 不同曝光時間抑制死菌DNA擴增Fig.2 Optimization of exposure time

2.3 EMA-PCR方法對腸炎沙門氏菌活菌檢測靈敏度分析

圖3 EMA對腸炎沙門氏菌活菌的影響Fig.3 Effect of EMA on viable salmonella enteritis cells

EMA質量濃度為50 μg/mL、曝光時間為10 min時，EMA-PCR方法對腸炎沙門氏菌活菌靈敏度檢測結果如圖3所示。EMA實驗組（圖3A）隨著菌液濃度的降低，DNA條帶亮度逐漸變暗，當稀釋度為10-6即菌液濃度為27.5 CFU/mL時，依然有目標條帶出現，所以其靈敏度檢測最低限為27.5 CFU/mL。此外，對比EMA實驗組（圖3A）與對照組（圖3B），當菌液濃度相同時，兩組 DNA條帶亮度基本一致，說明EMA處理不會影響腸炎沙門氏菌活菌DNA的擴增。

2.4 不同活菌比例混合菌液的EMA-PCR擴增

如圖4所示，不添加EMA的對照組雖然活菌比例不同，但是死菌和活菌的總量是一樣的，所以DNA條帶的亮度是一致，即使活菌比例是0%時依然有目標條帶出現；而添加EMA的實驗組，因為EMA會與死菌的DNA結合使其不能發生擴增反應，所以參與擴增反應的初始模板的量是不一樣的，故條帶的亮度是不同的，且當活菌比例是0%時沒有目標條帶出現。

圖4 EMA-PCR對腸炎沙門氏菌混合菌液的檢測Fig.4 Detection of mixed bacteria by EMA-PCR

3 討 論

EMA與PCR聯用的方法已用于多種目標菌的檢測[20-21]，但是不同種屬死菌DNA擴增被完全抑制所需EMA的濃度是不同的，EMA滲透到不同種屬的活菌細胞的能力也是不一樣的[22]，可能是由不同種屬菌細胞膜的流動性或滲透性不同所造成的[23]。Lee等[16]發現，若曝光時間定為10 min時，0.8 μg/mL的EMA即可抑制濃度為5×107CFU/mL的腐敗菌死菌的DNA擴增，質量濃度為10 μg/mL的EMA對活菌的DNA擴增沒有影響，當質量濃度達到50 μg/mL則會顯著影響活菌的DNA擴增；倫鏡盛等[24]研究表明，曝光時間為10 min時，2 μg/mL的EMA能有效的抑制1×108CFU/mL副溶血弧菌死菌PCR反應，EMA質量濃度為5 μg/mL時對活菌靶基因的擴增沒有明顯抑制，當質量濃度高于10 μg/mL時，PCR反應被顯著性抑制。Nocker等[23]利用SYTO9/EMA對活細胞進行染色時發現，EMA會將大腸桿菌O15∶H7等活菌細胞染成紅色，且50 μmol/mL EMA處理鏈球菌、微球菌、金黃色葡萄球菌活菌時會導致DNA提取量損失60%甚至更多，但是50 μmol/mL EMA不會對鼠傷寒沙門氏菌及黏質沙雷氏菌的DNA提取量造成損失。趙瑜等[25]研究發現，EMA質量濃度為從0 μg/mL增加到18 μg/mL時，樣品PCR條帶亮度無明顯減弱，表明低于18 μg/mL的EMA不會抑制沙門氏菌活菌的擴增。本實驗中當曝光時間為5 min時，50 μg/mL的EMA即能達到抑制2.75×107CFU/mL腸炎沙門氏菌死菌DNA擴增的目的，且對活菌沒有影響。

另外，曝光時間也是影響EMA抑制死菌PCR反應的關鍵因素。Helen等[26]使用EMA RT-PCR方法檢測果汁中的結合酵母，曝光時間從1 min延長至5 min時，EMA抑制5×107CFU/mL死菌DNA擴增的Ct值從29.7±0.179增加到37.9±1.817；Shi Hui等[27]證明曝光時間延長至20 min時ΔCt值會明顯大于曝光時間為5、10、15 min時的ΔCt值，而Lee等[16]研究發現，曝光時間為1 min時，目標條帶即消失。本實驗中，曝光時間為5 min時，目標條帶不再出現，但是為了實驗更加準確，將曝光時間定為10 min。

建立的EMA-PCR方法的靈敏度分析結果顯示，該方法的靈敏度與單一PCR方法相同，且用該方法檢測不同活菌比例的混合菌液時，目標DNA條帶亮度會隨著活菌所占比例的降低逐漸變暗，當活菌比例為0%時，沒有目標條帶出現，說明EMA-PCR方法在不影響檢測靈敏度的基礎上，可以克服死菌造成假陽性的缺點，為將該方法用于實際樣品檢測奠定了基礎。但是普通PCR無法對菌落數進行準確定量，后續研究可以將EMA與RT-PCR技術相結合，達到準確定量活菌數量的目的。

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Detection of Viable Cells of Salmonella enteritidis by EMA-PCR

YAN Cheng-ying1,2, TANG Xiao-yan2,*, WANG Min2, KANG Da-cheng2, LI Peng-ying2, ZHENG Xin1,2
(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

The combination of ethidium monoazide (EMA) and PCR was used for detecting viable cells of Salmonella enteritis. The optimization of experimental parameters showed that a final EMA concentration of 50 μg/mL and exposure time of 10 min could restrain DNA amplification of dead bacteria in 107CFU/mL of Salmonella enteritis. EMA-PCR and direct PCR methods showed the same detection limit of 27.5 CFU/mL for viable cells, suggesting that neither DNA amplification from viable cells nor PCR sensitivity is affected by the addition of EMA. As we observed for mixtures of viable and dead cells by the EMA-PCR method, the brightness of DNA stripes turned darker with reducing the proportion of viable cells, and when all bacteria were dead, no target stripe appeared. As for the control group without added EMA, the brightness of DNA stripe had no change, and even though the bacteria were all dead, the target stripe remained distinct. Therefore, the EMA-PCR method can distinguish dead bacteria from live ones, thereby avoiding false positive detection.

ethidium monoazide bromide (EMA); polymerase chain reaction (PCR); Salmonella enteritidis

TS251.7

A

1002-6630（2014）06-0090-04

10.7506/spkx1002-6630-201406018

2013-10-08

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B03）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31000799）；國家現代農業產業技術體系專項（CARS-42）

顏成英（1988—），女，碩士研究生，研究方向為畜產品質量與安全。E-mail：15116998250@163.com

*通信作者：湯曉艷（1976—），女，研究員，博士，研究方向為畜產品質量與安全標準與檢測。E-mail：txycaas@126.com