益智仁總黃酮超聲輔助提取工藝優化及其抗氧化活性

鄭 義，邵 穎，陳安徽，張娜娜

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇 徐州 221000；

2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221000）

益智仁總黃酮超聲輔助提取工藝優化及其抗氧化活性

鄭 義1,2，邵 穎1,2，陳安徽1,2，張娜娜1

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇 徐州 221000；

2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221000）

為優化益智仁總黃酮的超聲輔助提取工藝，通過單因素試驗考察乙醇體積分數、液料比、超聲時間和超聲功率對總黃酮得率的影響，在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken試驗設計，獲得益智仁總黃酮超聲輔助提取的最佳工藝；以總抗氧化能力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力、螯合鐵離子能力為指標，評價了益智仁總黃酮的抗氧化活性。結果表明：超聲輔助提取益智仁總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分數65%、液料比40∶1（mL/g）、超聲時間35 min、超聲功率360 W，在此條件下益智仁總黃酮得率為0.50%；益智仁總黃酮具有較好的抗氧化活性，總抗氧化能力、清除DPPH自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力和螯合鐵離子能力均與黃酮質量濃度表現出一定的量效關系；益智仁總黃酮清除DPPH自由基、清除超氧陰離子自由基和螯合鐵離子能力的半數有效濃度（EC50）分別為（2.85±0.20）、（0.87±0.05）g/L和（2.45±0.30）g/L。

益智仁；總黃酮；超聲輔助提取；抗氧化活性

益智仁為姜科植物益智（Alpinia oxyphylla）的干燥成熟果實，為衛生部認定的藥食同源的物品之一。益智仁含有豐富的碳水化合物、脂肪酸、蛋白質、維生素、微量元素等營養成分[1]。益智仁可用于治療腎虛遺尿、小便頻數、脾寒泄瀉、腹中冷痛等癥狀[2]。現代藥理學研究表明，益智仁還具有抗腫瘤、神經保護、免疫調節等藥理活性[3-6]。黃酮類化合物是益智仁的主要活性物質之一[7]，目前已從益智仁中分離出多種黃酮類物質，如白楊素、楊芽黃素、伊砂黃素、山萘酚-4’-O-甲醚等[8-11]。然而有關益智仁黃酮類化合物的提取工藝及抗氧化活性評價鮮有報道。傳統黃酮類物質的提取主要采用溶劑浸提法，存在耗時長、提取率低等缺點。超聲提取是利用超聲波產生的空化、振動等效應破碎原料細胞壁，加速細胞內有效成分的溶出、擴散，具有提取時間短、提取率高、不破壞有效成分等優點，該法已廣泛應用于天然產物的提取中[12]。本研究采用超聲輔助技術提取益智仁總黃酮，利用響應面法對提取工藝進行優化，采用多種方法評價益智仁總黃酮的抗氧化活性，旨在為開發以益智仁黃酮類化合物為主的藥品及功能食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益智仁產地海南；蘆丁標準品（批號：100080-200707） 中國食品藥品檢定研究院；總抗氧化能力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、菲咯嗪、氯化硝基四氮唑藍（nitroblue tetrazolium，NBT）、核黃素、蛋氨酸 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；BILON92-IID型超聲波細胞破碎機 西安德派生物科技有限公司；R201L旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠；3K30高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制作

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法[13]。稱取干燥至恒質量的蘆丁標準品25 mg，置于50 mL干燥燒杯中，加適量60%（V/V）的乙醇溶液，微熱溶解，轉移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得蘆丁標準溶液（0.25 g/L）。精密吸取蘆丁標準溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，分別置于7只25 mL容量瓶中，各加50 g/L亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加100 g/L三氯化鋁試液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加50 g/L的氫氧化鈉溶液10 mL，60%（V/V）乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min。以試劑空白做參比，在510 nm波長處測定吸光度A。以蘆丁質量濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為A＝0.011 8C＋0.002 5，R2=0.999 5。

1.3.2 益智仁總黃酮的提取

益智仁洗凈，適當切片，60 ℃干燥，恒質量后粉碎，石油醚脫脂3次，基本除去益智仁粉中的油脂，過60目篩，即為益智仁脫脂干粉。稱取一定量的益智仁脫脂干粉，加一定體積分數的乙醇溶液，在相應的功率下，超聲波細胞破碎機中提取一定時間，抽濾后得總黃酮提取液。總黃酮提取液濃縮后冷凍干燥得益智仁總黃酮粗粉。總黃酮粗粉溶解于適量60%（V/V）乙醇，按

1.3.1 節方法測定總黃酮得率。

1.3.3 單因素試驗

設定乙醇體積分數60%、液料比20∶1（mL/g）、超聲時間30 min、超聲功率400 W，固定其他條件，分別考察乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL/g）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、超聲功率（200、250、300、350、400 W）對益智仁總黃酮得率的影響，每組試驗重復3 次，取其平均值。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計

根據Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，以影響益智仁總黃酮得率的4 個因素：乙醇體積分數（x1）、液料比（x2）、超聲時間（x3）和超聲功率（x4）為自變量，以總黃酮得率（Y）為響應值，設計四因素三水平試驗，試驗因素水平表如表1所示。每組試驗重復3 次，取其平均值。

表 1 Box-Behnken試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experiments

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 總抗氧化能力測定

將益智仁總黃酮配成質量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 g/L的溶液，按照總抗氧化能力檢測試劑盒說明書操作，在520 nm波長處檢測吸光度。在37 ℃時，每分鐘每毫升樣品溶液使反應體系的吸光度每增加0.01時，定義為一個總抗氧化能力單位。以VC作為陽性對照。

式中：AU為測定管吸光度；AC為對照管吸光度；N為反應體系稀釋倍數（反應液總體積/取樣量）；n為樣品測試前稀釋倍數。

1.3.5.2 清除DPPH自由基能力測定

取不同質量濃度（0.5～7 g/L）的益智仁總黃酮，參考Wu Huichun等[14]的方法，在517 nm波長處檢測吸光度。以VC作為陽性對照。

清除率/%＝（1-（Ai-Aj）/AC）×100 （4）

式中：AC為1.5 mL蒸餾水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的體積分數95%乙醇所測定的吸光度；Ai為1.5 mL樣品液加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇所測定的吸光度；Aj為1.5 mL樣品液加1.5 mL 95%乙醇所測定的吸光度。

1.3.5.3 清除超氧陰離子自由基能力測定

配制不同質量濃度（0.1～10 g/L）的樣品溶液，采用光照核黃素體系法[15]，在560 nm波長處檢測吸光度，VC作為陽性對照。

清除率/%=（A0-AS）/A0×100 （5）

式中：A0為光照空白管吸光度；AS為樣品管的吸光度。

1.3.5.4 鐵離子螯合能力測定

鐵離子鰲合能力的測定采用Decker等[16]的方法，略有改動。在2 mL不同質量濃度（0.5～10 g/L）的樣品溶液中，加入0.02 mL 5 mmol/L 的FeCl2，再加0.2 mL 5 mmol/L菲咯嗪，室溫下靜置10 min，加入等體積的蒸餾水，搖勻，于562 nm波長下測量吸光度。EDTA作為陽性對照。

鐵離子螯合率/%=（A0-AS）/A0×100 （6）

式中：A0為空白對照的吸光度；AS為樣品或陽性對照的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

圖1 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

如圖1所示，乙醇體積分數小于60%時，總黃酮得率隨乙醇體積分數的增大而增大，當乙醇體積分數超過60%以后，總黃酮得率又急劇下降。乙醇體積分數為60%的總黃酮得率顯著高于乙醇體積分數為50%、70%的得率（P＜0.05）。主要原因是不同體積分數的乙醇極性不同，隨著乙醇體積分數的增大，脂溶性物質如色素、鞣質等溶出增多，影響了總黃酮的浸出[17]。故乙醇體積分數宜為60%。

2.1.2 液料比對總黃酮得率的影響

圖2 液料 比對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solvent-to-solid ratio on the yield of total flavonoids

如圖2所示，總黃酮得率隨著乙醇用量的提高而增大，液料比達到40∶1（mL/g）后，總黃酮得率增加緩慢，液料比為40∶1和50∶1（mL/g）時的總黃酮得率差異不顯著（P＞0.05）。液料比過大，將會導致后續操作能耗加大，從降低成本、節約能源的角度考慮，液料比宜在40∶1（mL/g）左右。

2.1.3 超聲時間對總黃酮得率的影響

圖3 超聲時間對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the yield of total flavonoids

如圖3所示，總黃酮得率在10～30 min的超聲時間內呈顯著增加的趨勢，超聲時間超過30 min后，總黃酮得率增幅緩慢，超聲時間為30 min和40 min時的總黃酮得率差異不顯著，超聲時間為40 min和50 min時的總黃酮得率差異亦不顯著。考慮到能耗，故選擇30 min為超聲時間較優值。

2.1.4 超聲功率對總黃酮得率的影響

由圖4可知，總黃酮得率隨著超聲功率的增大而增大，但超聲功率在350 W以后，總黃酮得率增幅緩慢，350 W和400 W時的總黃酮得率差異不顯著。這是由于胞內物質的提取包括擴散、滲透、溶解等過程，超聲功率增大，空化作用增強，導致細胞破裂程度增大，有利于黃酮的溶出，但當擴散達到平衡時，再增大超聲功率，得率幾乎不再增大[18]，故選擇350 W為超聲功率較優值。

圖4 超聲功率對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids

2.2 Box-Behnken試驗

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗

表 2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

對表2試驗數據用多元回歸擬合后，得到總黃酮得率（Y）與乙醇體積分數（x1）、液料比（x2）、超聲時間（x3）和超聲功率（x4）的回歸方程：Y=0.474＋0.031 7x1＋0.025x2＋0.024 2x3＋0.034 2x4-0.01x1x2＋0.075x1x3-0.037 5x2x3＋0.037 5x2x4-0.025x3x4-0.048 7x12-0.091 2x2

2-0.104 9x32-0.074 9x42。

對該回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表 3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

該模型達到極顯著水平（P＜0.01），失擬項 不顯著（P＞0.05），決定系數R2為0.953 2，校正決定系數R為0.906 3，信噪比RSN為14.95，可知該回歸方程擬合度和可信度均很高，故可用于設計范圍內的預測。

對表3回歸模型系數的顯著性分析可見，一次項的回歸系數均達到極顯著水平；平方項的回歸系數均極顯著；交互項中x1x3的回歸系數達到極顯著水平，x2x3和x2x4的回歸系數達到顯著水平，表明乙醇體積分數與超聲時間、液料比與超聲時間、液料比與超聲功率的交互作用對總黃酮得率有顯著影響。

2.2.2 兩因素間的交互效應分析

為考察兩因素間交互效應對總黃酮得率的影響，可固定其他因素為零水平，繪制響應面。由表3可知，乙醇體積分數與超聲時間、液料比與超聲時間、液料比與超聲功率的交互作用對總黃酮得率有顯著影響，其響應面分別如圖5所示。響應面坡度越陡峭，表明總黃酮得率對于該因素的改變越敏感。由圖5A可知，當乙醇體積分數處于較低水平時，隨著超聲時間的延長，總黃酮得率呈現出先緩慢上升后下降的趨勢；當乙醇體積分數處于較高水平時，隨著超聲時間的延長，總黃酮得率呈現出先上升后緩慢下降的趨勢。由圖5B可知，當液料比處于較低水平時，隨著超聲時間的延長，總黃酮得率先急劇上升后緩慢下降；當液料比處于較高水平時，隨著超聲時間的延長，總黃酮得率呈現出先增加后緩慢下降的趨勢。圖5C中總黃酮得率的變化趨勢與圖5B類似。從圖5可以得出，要達到最佳提取效果，提取條件應控制在乙醇體積分數65%左右，液料比40∶1（mL/g）左右，超聲時間30～35 min，超聲功率350～375 W。

圖5 兩因素交互效應對總黃酮得率的影響Fig.5 Interactive effects of four extraction parameters on the yield of total flavonoids

2.2.3 最佳條件優化及驗證結果

通過對2.2.1節的回歸方程求二階偏導，得到最佳提取工藝條件為乙醇體積分數65.78%、液料比40.99∶1（mL/g）、超聲時間33.41 min、超聲功率365.46 W，在此條件下益智仁總黃酮得率理論值為0.49%。考慮實際操作情況，將最佳提取工藝修正為乙醇體積分數65%、液料比40∶1（mL/g）、超聲時間35 min、超聲功率360 W。在此修正條件下，實測總黃酮得率為0.50%，與理論值基本一致，益智仁總黃酮純度為52.16%，表明該工藝對于指導生產實踐具有一定的借鑒意義。

2.3 益智仁總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 總抗氧化能力

抗氧化物質能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質形成穩固的配合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低[19]。益智仁總黃酮的總抗氧化能力如圖6所示，在0.1～1.0 g/L的質量濃度范圍內，益智仁總黃酮的總抗氧化能力隨質量濃度增大而提高，質量濃度為0.1 g/L時，總抗氧化能力為（20.26±2.00）U/mL，質量濃度為1 g/L時，總抗氧化能力達到了（187.43±6.00）U/mL，在測定的質量濃度范圍內，益智仁總黃酮的總抗氧化能力不及VC。

圖6 益智仁總黃酮的總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits

2.3.2 清除DPPH自由基能力

DPPH法是評價抗氧化活性的常用方法，抗氧化物質可直接作用于DPPH自由基，使其顏色變淺，根據分光光度計可測定物質的抗氧化活性[20]。益智仁總黃酮對DPPH自由基的清除作用如圖7所示。

圖7 益智仁總黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits against DPPH free radicals

由圖7可知，在測定的質量濃度范圍，益智仁總黃酮對DPPH自由基的清除能力呈現出劑量依賴性。質量濃度為1 g/L時，清除率為（20.35±1.00）%，質量濃度為3 g/L時，清除率為（48.97±2.00）%，質量濃度為6 g/L時，清除率達到了（92.96±3.00）%。益智仁總黃酮清除DPPH自由基的能力在低質量濃度時不如VC，但高質量濃度時與VC相當。

半數有效濃度（median effective concentration，EC50）是指清除率為50%時的樣品質量濃度，如某種物質的EC50低于10 g/L，則表明其具有很好的抗氧化活性[9]。采用Logit回歸計算出益智仁總黃酮及VC的EC50分別為（2.85±0.2）、（0.09±0.001）g/L。益智仁總黃酮清除DPPH自由基的EC50遠小于10 g/L，由此可見益智仁總黃酮具有明顯清除DPPH自由基的能力。

2.3.3 清除超氧陰離子自由基能力

圖8 益智仁總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits against superoxide anion free radicals

在測量的質量濃度范圍內，益智仁總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用隨著質量濃度的增加先增加，接著趨于平穩。當質量濃度為0.5 g/L時，清除率為（42.22±0.80）%；當質量濃度為2 g/L時，清除率為（67.75±2.00）%，當質量濃度為5 g/L時，清除率達到了（93.28±1.00）%；在測量的質量濃度范圍內，益智仁總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用強于VC。益智仁總黃酮與VC對超氧陰離子自由基清除作用的EC50分別為（0.87±0.05）、（1.21±0.10）g/L。

2.3.4 鐵離子螯合能力

圖9 益智仁總黃酮對鐵離子的螯合作用Fig.9 Ferrous ion chelating ability of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits

在質量濃度為0.5～10 g/L的范圍內，益智仁總黃酮對鐵離子的螯合能力呈現出劑量依賴性。質量濃度為1 g/L時，螯合率為（20.50±0.70）%；質量濃度為6 g/L時，螯合率達到了（91.02±2.00）%；質量濃度為10 g/L時，螯合率96.48%。陽性對照EDTA在質量濃度為1 g/L時，螯合率已達到（86.92±1.00）%。益智仁總黃酮與EDTA對鐵離子螯合能力的EC50分別為（2.45±0.30）、（0.12±0.02）g/L。

3 結 論

本研究建立了超聲輔助提取益智仁總黃酮的最佳工藝條件，即乙醇體積分數65%、液料比40∶1（mL/g）、超聲時間35 min、超聲功率360 W，在此條件下總黃酮得率為0.50%。表明該模型具有較好的預測性能，對于指導生產實踐具有一定借鑒意義。

在測定的質量濃度范圍，益智仁總黃酮的總抗氧化能力、清除DPPH自由基能力、清除超氧陰離子自由基和螯合鐵離子能力均隨質量濃度的增加而增大。益智仁總黃酮清除DPPH自由基、清除超氧陰離子自由基和螯合鐵離子能力的EC50分別為（2.85±0.20）、（0.87±0.05）、（2.45±0.30）g/L。益智仁總黃酮表現出較好的抗氧化活性，可作為潛在天然抗氧化劑應用于藥品及功能食品中，而有關益智仁總黃酮的結構鑒定及動物模型實驗有待進一步研究。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidant Activities of Total Flavonoids from Alpinia oxyphylla Fruits

ZHENG Yi1,2, SHAO Ying1,2, CHEN An-hui1,2, ZHANG Na-na1
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221000, China; 2. Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou 221000, China)

The ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits was optimized by response surface methodology. One-factor-at-a-time experiments were carried out to investigate the effects of ethanol concentration, solvent-to-solid ratio, ultrasonic treatment time and power on the extraction yield of total flavonoids. This was followed by mathematical modeling based on a Box-Behnken design and response surface analysis. Anti oxidant activities of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits were evaluated by in vitro antioxidant assays: total antioxidant capacity, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, superoxide anion radical scavenging activity and ferrous ion chelating ability. The results showed that the optimal extraction parameters were determined as 65%, 40:1 (mL/g), 35 min and 360 W for ethanol concentration, solvent-to-solid ratio, ultrasonic treatment time and power, respectively. The yield of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits could be up to 0.50% under these conditions. Total antioxidant capacity, DPPH radical scavenging activity, superoxide anion scavenging activity and ferrous ions chelating ability of total flavonoids from Alpinia oxyphylla fruits were concentration dependent. The median effective concentrations (EC50) for DPPH radical scavenging activity, superoxide anion scavenging activity and ferrous ion chelating ability were (2.85 ± 0.20), (0.87 ± 0.05) and (2.45 ± 0.30) g/L respectively.

Alpinia oxyphylla fruits; total flavonoids; ultrasonic-assisted extraction; antioxidant activity

R284.2

A

1002-6630（2014）06-0044-06

10.7506/spkx1002-6630-201406009

2013-06-21

國家星火計劃項目（2012GA690326）；江蘇省高校自然科學研究項目（13KJD550006）；徐州市科技計劃項目（XZZD1307）

鄭義（1982—），男，講師，碩士，研究方向為天然產物與食品生物技術。E-mail：biozheng@gmail.com