PXR基因多態(tài)性與心臟移植術(shù)后穩(wěn)定期環(huán)孢素血藥濃度的相關(guān)性

石秀錦，魏國(guó)義，林 陽(yáng)，鐘 逾，張海波，孟 旭，秦 英，李 驍，白玉國(guó)，鄭青敏，周 洋，賈一新（.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院藥劑科，北京 0009；.毅新興業(yè)（北京）科技有限公司，北京 00080；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心外科，北京 0009）

PXR基因多態(tài)性與心臟移植術(shù)后穩(wěn)定期環(huán)孢素血藥濃度的相關(guān)性

石秀錦1，魏國(guó)義1，林 陽(yáng)1，鐘 逾2，張海波3，孟 旭3，秦 英1，李 驍1，白玉國(guó)1，鄭青敏1，周 洋1，賈一新3（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院藥劑科，北京 100029；2.毅新興業(yè)（北京）科技有限公司，北京 100080；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心外科，北京 100029）

目的：探討心臟移植患者術(shù)后口服免疫抑制劑環(huán)孢素的血藥濃度與PXR基因多態(tài)性的相關(guān)性。方法：應(yīng)用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)59例心臟移植術(shù)后穩(wěn)定期患者的PXR基因型進(jìn)行檢測(cè)，全自動(dòng)化學(xué)免疫分析儀測(cè)定環(huán)孢素的血藥濃度，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析PXR各單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)基因型對(duì)環(huán)孢素血藥濃度的影響。結(jié)果：PXR基因篩選出的8個(gè)Tag SNP位點(diǎn)次要等位基因頻率（MAF）與NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)人的數(shù)據(jù)相近。對(duì)于59名穩(wěn)定期心臟移植患者PXR基因8個(gè)Tag SNP中，僅攜帶PXR rs1523127（C 24381 A）位點(diǎn)AA型基因的患者血藥濃度及校正血藥濃度明顯低于CA型，CA型又低于CC型患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。其他7個(gè)Tag SNP rs3814056T ＞ G、rs7643645A ＞ G、rs11917714C ＞ T、rs2276705C ＞ A、rs2472681T ＞ C、rs2472682C ＞ A、rs4440154C ＞ T各基因型組間環(huán)孢素血藥濃度的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：PXR rs1523127（C 24381 A）基因型與心臟移植穩(wěn)定期患者環(huán)孢素血藥濃度顯著相關(guān)，提示該SNP可能會(huì)在環(huán)孢素個(gè)體化用藥中發(fā)揮重要作用。

飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)；心臟移植；環(huán)孢素；血藥濃度；孕烷X受體；基因多態(tài)性

心臟移植是治療各種原因所致終末期心臟病的有效方法。免疫抑制治療是關(guān)系到心臟移植術(shù)后能否長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵因素之一[1]。環(huán)孢素（cyclosporine A，CsA）因具有較強(qiáng)的免疫活性，已成為廣泛用于器官移植術(shù)后抗排異反應(yīng)的基礎(chǔ)免疫抑制劑。該藥在發(fā)揮療效的同時(shí)，表現(xiàn)出明顯的藥代動(dòng)力學(xué)個(gè)體差異以及狹窄的治療窗。因此，需要對(duì)服藥患者定時(shí)進(jìn)行CsA血藥濃度監(jiān)測(cè)，以保證最佳治療效果并最大限度地減少排斥反應(yīng)及毒副作用。目前，臨床多根據(jù)體質(zhì)量確定CsA的初始劑量，維持劑量依據(jù)CsA全血谷濃度（C0）、峰濃度（C2）及患者情況進(jìn)行調(diào)整。但上述方法難以針對(duì)不同個(gè)體最佳初始劑量作出準(zhǔn)確、有效的判斷。隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展，通過(guò)基因水平檢測(cè)信息對(duì)藥物體內(nèi)代謝強(qiáng)度進(jìn)行預(yù)判已受到廣大學(xué)者的關(guān)注。本研究旨在探討CsA 代謝酶CYP3A4以及轉(zhuǎn)運(yùn)體P-糖蛋白（P-gp）編碼基因共同的上游調(diào)控基因孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）的基因多態(tài)性對(duì)心臟移植術(shù)后穩(wěn)定期患者CsA血藥濃度的影響，旨在為臨床合理用藥提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2004年1月– 2012年12月在北京安貞醫(yī)院接受心臟移植手術(shù)并門(mén)診隨訪的患者。入選條件為心臟移植術(shù)后接受環(huán)孢素、嗎替麥考酚酯和糖皮質(zhì)激素三聯(lián)免疫抑制方案，漢族，術(shù)后時(shí)間≥6個(gè)月，環(huán)孢素服用≥2個(gè)月，未聯(lián)合使用CYP3A的誘導(dǎo)劑或抑制劑，且臨床相應(yīng)研究資料以及DNA標(biāo)本可以獲得。依據(jù)以上入選條件共篩選了59例心臟移植患者參與該項(xiàng)研究。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者或其家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集與分離

隨訪時(shí)，收集患者清晨服藥前靜脈血進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，留取監(jiān)測(cè)后乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的靜脈全血2 mL，應(yīng)用全基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司），按照說(shuō)明書(shū)從1 mL外周血中提取白細(xì)胞基因組DNA，溶解于0.1×TE緩沖液中（10 mmol·L-1Tris-HCL，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0），于– 20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ褂们敖?jīng)DU 800 spectrophotometer 檢測(cè)，D（260）/D（280）均在1.6 ～2.0 范圍內(nèi)，DNA濃度均在10 ng·mL-1以上。

1.3 環(huán)孢素血藥濃度的測(cè)定

CsA血藥濃度首次測(cè)定在患者規(guī)律服用CsA 2 ～6 d后進(jìn)行，術(shù)后3個(gè)月內(nèi)每月監(jiān)測(cè)2 ～ 3次，3個(gè)月后每月監(jiān)測(cè)1次。若血藥濃度過(guò)高或偏低，則調(diào)整CsA劑量，并于調(diào)整劑量后2 ～ 6 d再予測(cè)定，直至達(dá)到治療濃度范圍。每次均在清晨服藥前取外周靜脈血2 mL，置于EDTA-K抗凝管，應(yīng)用AxSYM全自動(dòng)化學(xué)免疫分析儀（美國(guó)雅培公司）測(cè)定CsA的谷濃度（C0）。CsA血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為5 ～ 800 μg·L-1。根據(jù)個(gè)體服藥劑量，計(jì)算出血藥濃度與劑量比，以此作為校正血藥濃度。

1.4 標(biāo)簽SNP的選擇

使用HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)的人類(lèi)全基因組的SNP基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)簽位點(diǎn)的選擇。標(biāo)簽位點(diǎn)篩選遵循連鎖不平衡值（r2）＞ 0.8的原則，即標(biāo)簽位點(diǎn)與所代表的位點(diǎn)之間有足夠強(qiáng)的連鎖不平衡（r2值＞ 0.8）[2]。再使用Haploview 4.2程序?qū)腍apMap下載的中國(guó)漢族人群（CHB）基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)簽位點(diǎn)的選擇，選擇的位點(diǎn)僅限次要等位基因頻率（The minor allele frequency, MAF） ＞ 0.01，本研究共從PXR基因相關(guān)序列中找到8個(gè)Tag SNP。

1.5 SNP質(zhì)譜分型

應(yīng)用Sequenom公司的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)（MALDI-TOF MS）中的iPLEX試劑盒進(jìn)行SNP基因型分析[3]。其步驟簡(jiǎn)述如下：1）多重PCR引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增：5 μL反應(yīng)體系中包括1×反應(yīng)緩沖液，10 ng基因組DNA，0.5 U熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶（HotStarTaq，Qiagen公司），500 μmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），每個(gè)位點(diǎn)100 nmol·L-1上游和下游引物，置于384孔板中，使用ABI-9700 PCR擴(kuò)增儀，于94 ℃15 min活化DNA 聚合酶后，于94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循環(huán)45次。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。2）去除未反應(yīng)的引物和dNTPs。PCR擴(kuò)增后，在反應(yīng)體系中加入2 μL 0.3 U 蝦堿性磷酸酶（SAP），于37 ℃下恒溫20 min進(jìn)行多余堿基消減反應(yīng)，再置于85 ℃放置5 min進(jìn)行滅活。3）單堿基延伸PCR反應(yīng)。應(yīng)用iPLEX試劑盒。調(diào)節(jié)延伸引物的濃度，降低質(zhì)譜峰圖的背景噪音后，在9 μL反應(yīng)體系中加入100 μmol·L-1dNTP 0.2 μL、0.05單位的上述DNA聚合酶0.04 μL、及625 ～1 250 nmol·L-1的延伸引物。先置PCR擴(kuò)增儀94 ℃ 30 s，再進(jìn)行延伸PCR反應(yīng)循環(huán)：置94 ℃ 5 s，5 ×（52 ℃ 5 s + 80 ℃ 5 s），該循環(huán)共200次；最后置72 ℃延伸3 min。置4 ℃保存。4）純化的延伸反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行MALDITOF-MS分析：上述樣品應(yīng)用6 mg樹(shù)脂脫鹽處理后，應(yīng)用自動(dòng)機(jī)械臂點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移至Sequenom的384孔質(zhì)譜芯片上，另在384孔質(zhì)譜芯片上設(shè)置4個(gè)孔的重復(fù)質(zhì)控樣品。在質(zhì)譜分型系統(tǒng)中對(duì)點(diǎn)樣后的質(zhì)譜芯片進(jìn)行基因分型。5）數(shù)據(jù)采集和基因型分析：不同的波譜峰形狀代表電荷標(biāo)記的不同質(zhì)量。如果產(chǎn)物中存在兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，每一個(gè)位點(diǎn)有一個(gè)等位基因，那么該等位基因是純合子；如果質(zhì)譜儀捕捉到4個(gè)不同的波譜峰，那么兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性是雜合子。通過(guò)操作界面Typer 4.0軟件包讀取質(zhì)譜峰圖，獲得基因型數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

59例心臟移植患者中，男性50例，女性9例，平均年齡（42.47±14.53）歲，平均體質(zhì)量（67.37± 15.11） kg，平均身高（171.76±8.59） cm。

2.2 PXR基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）的相關(guān)信息

PXR基因SNP的rs編號(hào)、染色體位置和等位基因頻率見(jiàn)表1。所有位點(diǎn)均通過(guò)了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（P ＞ 0.05）。本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)PXR 8個(gè)Tag SNP位點(diǎn)次要等位基因頻率（MAF）與NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)人的數(shù)據(jù)相近。

表1 PXR基因8個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）的相關(guān)信息Tab 1 Information about 8 genotyped SNP of PXR gene

2.3 PXR基因分型結(jié)果及其對(duì)心臟移植患者環(huán)孢素藥物濃度的影響

對(duì)于59名穩(wěn)定期心臟移植患者PXR基因8個(gè)Tag SNP中，僅攜帶PXR rs1523127（C 24381 A）位點(diǎn)AA型基因的患者血藥濃度及校正血藥濃度明顯低于CA型，CA型又低于CC型患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。其他7個(gè)Tag SNP rs3814056T ＞ G、 rs7643645A ＞G、rs11917714C ＞ T、rs2276705C ＞ A、rs2472681T ＞ C、rs2472682C ＞ A、rs4440154C ＞ T各基因型組間環(huán)孢素血藥濃度的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表2。

表2 PXR基因8個(gè)SNP基因分型及其對(duì)心臟移植患者環(huán)孢素血藥濃度的影響Tab 2 Genotype frequencies of 8 Tags SNP of PXR gene and its in fl uence on the cyclosporine blood concentration of heart transplant patients

3 討論

環(huán)孢素主要經(jīng)CYP3A4、CYP3A5代謝，同時(shí)也是P-gp的底物，CYP3A5呈現(xiàn)顯著的個(gè)體差異，與CsA 首過(guò)清除有緊密關(guān)系，多藥耐藥酶基因1（multidrug resistance gene 1, MDR1）編碼CsA的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp，其外顯子上的突變使得P-gp的表達(dá)和功能發(fā)生改變[4]。故小腸壁上皮細(xì)胞中P-gp活性及CYP3A4、CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)CsA血藥濃度有重要的影響[5]。近年來(lái)，核受體作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)調(diào)控中所起的重要作用逐漸被認(rèn)識(shí)。其中， PXR屬核受體NR1I亞家族，由NR1I2基因編碼，是機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)，能同時(shí)調(diào)控代謝酶CYP3A4、CYP3A5以及轉(zhuǎn)運(yùn)體P-糖蛋白等多種基因的表達(dá)[6]，因此NRlI2的基因多態(tài)性也可能通過(guò)影響CYP3A4、CYP 3A5、MDRl的表達(dá)從而間接影響環(huán)孢素的藥動(dòng)學(xué)。

本研究結(jié)果顯示：59例心臟移植受者PXR 8個(gè)Tag SNP位點(diǎn)次要等位基因頻率（MAF）與NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的中國(guó)人的次要等位基因頻率相近。其中，PXR 7個(gè)Tag SNP位點(diǎn)的基因多態(tài)性對(duì)心臟移植受者CsA血藥濃度均無(wú)影響；僅PXR rs1523127（C 24381 A）基因多態(tài)性對(duì)CsA血藥濃度有明顯影響，擬取得相同的血藥濃度，攜帶突變型純合子AA型患者要比突變型雜合子AC型和野生型CC型服用更高劑量的CsA。PXR rs1523127（C 24381A）位于5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR），突變頻率為31.2%，與NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的中國(guó)人的突變頻率相近，而C24381A的突變頻率在中國(guó)健康漢族人與已報(bào)道的白人和美國(guó)黑人有顯著性差異[7]。已有研究表明該位點(diǎn)與CYP3A4的表型及腸道P-gp含量相關(guān)[8]，進(jìn)而影響CsA的血藥濃度。Press等[9]對(duì)33例腎移植患者ABCB1、CYP3A4、CYP3A5和PXR（包括PXR C24381A）基因多態(tài)性對(duì)CsA藥代動(dòng)力學(xué)的影響進(jìn)行了非線性混合效應(yīng)模型研究，發(fā)現(xiàn)所選基因?qū)sA清除率沒(méi)有很大的影響。國(guó)內(nèi)目前未見(jiàn)關(guān)于PXR C24381A對(duì)環(huán)孢素藥動(dòng)學(xué)影響的報(bào)道。李澎灝等[10]對(duì)60例腎移植受者PXR與他克莫司藥動(dòng)學(xué)的相關(guān)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)PXR C24381A（rs1523127）基因多態(tài)性突變頻率為25%，對(duì)他克莫司血藥濃度亦有明顯影響，攜帶突變型純合子AA型患者要比突變型雜合子AC型和野生型CC型服用更高劑量的他克莫司，研究結(jié)論與本研究一致。由此可見(jiàn)，CsA劑量調(diào)整的谷濃度是否會(huì)受到PXR C24381A基因多態(tài)性的影響，結(jié)果存在爭(zhēng)議，這可能與實(shí)驗(yàn)病例較少，PXR基因多態(tài)性存在很大的種族差異性以及該基因并非是影響CsA代謝唯一因素等有關(guān)，仍需要對(duì)不同種族之間進(jìn)行大樣本對(duì)比研究。

藥物基因組學(xué)為基因?qū)騻€(gè)體化藥物治療提供了新策略，用基因參數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)免疫抑制劑的最合適服用初始劑量將會(huì)促進(jìn)藥物最佳臨床療效發(fā)揮。雖然它不能替代傳統(tǒng)TDM，但對(duì)基因型探尋可以確定小部分患者對(duì)藥物的高敏感型或者毒副反應(yīng)的危險(xiǎn)度，最終對(duì)于移植受者基因型可以添加到在選擇免疫抑制劑方案中的己知危險(xiǎn)因素中，為移植患者合理有效的個(gè)體化應(yīng)用免疫抑制劑提供了更多的信息。

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Relationship between genetic polymorphisms of PXR and cyclosporine blood concentration of stable heart transplant recipients

SHI Xiu-jin1, WEI Guo-yi1, LIN Yang1, ZHONG Yu2, ZHANG Hai-bo3, MENG Xu3, QIN Ying1, LI Xiao1, BAI Yu-guo1, ZHENG Qing-min1, ZHOU Yang1, JIA Yi-xin3(1. Department of Pharmacy, Beijing Anzhen Hospital Af fi liated to the Capital Medical University, Beijing 100029, China; 2. Bioyong Technologies Inc., Beijing 100080, China; 3. Department of Cardiac Surgery, Beijing Anzhen Hospital Af fi liated to the Capital Medical University, Beijing 100029, China)

Objective:To investigate the correlation between gene polymorphisms of pregnane X receptor (PXR) and cyclosporine blood concentration in heart transplant patients.Methods:MassARRAY was applied to detect the PXR genotypes of 59 stable heart transplant recipients. AxSYM fully-automated chemistry immune analyzer was used to detect the blood concentration of cyclosporine. And then the in fl uence of the genotypes of PXR single nucleotide polymorphism (SNP) on cyclosporine trough blood concentration was analyzed by statistical method.Results:The minor allele frequency (MAF) in 8 tags of PXR SNP of 59 patients obtained in this study was similar with that in NCBI's dbSNP database of Chinese population. The blood concentration and corrected concentration of cyclosporine in PXR rs1523127 (C 24381 A) AA patients were obviously lower than those of CA patients, and those of CA patients were obviously lower than those of CC patients (P ＜ 0.05). There was no statistical difference in the cyclosporine blood concentrations in patients with the other seven PXR Tag SNP (rs3814056T ＞ G, rs7643645A ＞ G, rs11917714C ＞ T, rs2276705C ＞ A, rs2472681T ＞ C, rs2472682C ＞ A, rs4440154C ＞ T).Conclusion:There was signi fi cant correlation between PXR rs1523127 (C24381A) genotype and cyclosporine blood concentration in stable heart transplant recipients, which indicated that this SNP may play an important role in the individual application of cyclosporine.

MassARRAY; Heart transplantation; Cyclosporine; Blood drug concentration; Pregnane X receptor (PXR); Genetic polymorphism

R979.5

A

1672 – 8157(2014)03 – 0152 – 04

2014-02-20

2014-04-08）

魏國(guó)義，女，主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)與藥事管理。E-mail：weiguoyi2013@163.com

石秀錦，女，主管藥師，研究方向：臨床藥學(xué)與個(gè)體化用藥。E-mail：xiujinshi@163.com