羅非魚皮膠原蛋白肽亞鐵螯合修飾及螯合物性質的研究

段 秀，楊成濤，孫 云，孫麗平，莊永亮

（昆明理工大學化學工程學院食品科學研究中心，云南昆明650500）

羅非魚皮膠原蛋白肽亞鐵螯合修飾及螯合物性質的研究

段 秀，楊成濤，孫 云，孫麗平*，莊永亮

（昆明理工大學化學工程學院食品科學研究中心，云南昆明650500）

以羅非魚皮為原料制備膠原蛋白肽（TSGP），膠原蛋白肽與亞鐵鹽進行螯合反應，對TSGP亞鐵螯合物的理化性質及功能特性進行研究。實驗優化得出最佳螯合反應條件是m多肽∶mFeCl2·4H2O=500∶1，pH為6.0，反應時間50min，溫度35℃。通過熒光光譜、紫外光譜和紅外光譜測定發現Fe2+與TSGP的羧基與氨基均可發生配位反應。抗氧化活性測定實驗表明，螯合物具有較強的清除DPPH自由基和ABTS+自由基的能力。

羅非魚皮，膠原蛋白肽，亞鐵螯合物，結構，抗氧化

羅非魚（tilapia）屬于鱸形目麗魚科羅非魚屬，是世界上重要的淡水養殖魚類。在過去的幾年中，羅非魚的生產量穩步增長，并已成為領先出口的水產品之一。

據報道，羅非魚皮膠原蛋白占魚皮干重的70%，國內外對于魚類膠原多肽進行了大量研究，發現其具有良好的生物活性，如抗氧化活性[1]、降血壓活性[2]、抗腫瘤活性[3]以及免疫調節[4]等。此外，魚皮膠原蛋白活性肽與金屬離子如鐵、鋅、鈣等也有很好的螯合活性[5-7]。研究表明，蛋白酶將食品蛋白質水解成肽段，其中有些具有廣泛的生理活性，但同時大量肽段沒有生物學活性，這些肽段經過一定修飾后具有意想不到的活性[8]。選擇合適的蛋白酶水解這些多肽鏈，并進行適當的修飾，可制備出具有各種生理功能的生物活性肽。近年來隨著科學研究的深入，各種修飾生物活性肽不斷被發現。

本論文以羅非魚皮為研究對象，使用中性蛋白酶進行水解，再將制備的羅非魚皮膠原蛋白肽（TSGP）亞鐵螯合修飾，然后對所得TSGP亞鐵螯合物進行理化性質及功能性質分析，為TSGP亞鐵螯合物的分離、鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚皮 由昆明新海洋食品公司提供；中性蛋白酶（≥6萬活力單位） 購買于杰能科國際公司；其他所用試劑 均為分析純。

AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG9140型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；SB5200D型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；KW 1000DC型數顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；HJ-2磁力加熱攪拌器 國華電器有限公司；TDL-40B型離心機 上海安亭科學儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；真空冷凍干燥機 南京載智自動化設備有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；RF-5310PC熒光分光光度計 日本島津公司；TENSOR27-紅外光譜儀 德國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚皮膠原蛋白提取 熱水提取法[1]：魚皮解凍后，清洗干凈并瀝干，然后用7倍體積的0.2%氫氧化鈉溶液浸泡并不斷攪動，40m in后用流動水沖洗至中性；再用7倍體積的0.2%硫酸溶液浸泡并不斷攪動，40min后用流動水沖洗至中性；最后將魚皮加10倍蒸餾水勻漿，用45℃熱水恒溫提取12h，離心（5000r/m in，20m in）所得上清液即為膠原蛋白，冷凍干燥后備用。

1.2.2 TSGP的制備 用磷酸鹽緩沖液配制10mg/m L的膠原蛋白液，用中性蛋白酶進行水解，酶解條件為pH 7，酶用量5%，溫度45℃，時間3h。酶解完成后，95℃滅酶15min，離心收集上清液，即得TSGP。濃縮、凍干后，于-20℃凍存備用。

1.2.3 TSGP亞鐵螯合物的制備 設計四因素三水平正交實驗，因素水平見表1。以亞鐵螯合率為指標，通過極差分析，得出最佳工藝條件。

表1 TSGP亞鐵螯合物制備正交實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of TSGP iron-chelating orthogonal experiment

1.2.4 水解度（DH）的測定 根據趙新淮等的方法進行測定[9]。

1.2.5 亞鐵螯合活性測定 參照Park等[10]的方法稍作修改，將樣品pH調至5.5，取3m L加入0.1m L 2mmol/L FeCl2·4H2O，5min后，再加入0.2m L 5mmol/L菲洛嗪（ferrozine），室溫下放置10m in，在562nm處測定吸光值。螯合率計算公式如下：

螯合率（%）=[（A0－（A1－A2））/A0]×100

其中A0：磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）+FeCl2·4H2O+菲洛嗪；A1：樣品+FeCl2·4H2O+菲洛嗪；A2：樣品+FeCl2· 4H2O+水。

1.2.6 TSGP氨基酸組成及含量測定 采用高效液相色譜的方法測定。

1.2.7 TSGP亞鐵螯合物的定性檢測 定性檢測：Na2S法[11]。

1.2.8 組成成分測定 水分的測定：直接干燥法；多肽的測定：凱氏定氮法；鐵含量的測定：鄰菲羅琳比色法。

1.2.9 TSGP亞鐵螯合物的結構表征

1.2.9.1 熒光光譜分析 所有實驗均在常溫下進行，5m in后，分別對樣品及樣品與FeCl2·4H2O的混合物，在激發波長為289nm，發射波長310～400nm范圍內，每隔1nm進行光譜掃描。時間光譜掃描中，激發波長為289nm，發射波長為371nm，每分鐘掃描一次。

1.2.9.2 紫外掃描分析 將TSGP以及TSGP亞鐵螯合物配成一定濃度的水溶液，在190～400nm范圍內進行紫外掃描。

1.2.9.3 紅外光譜分析 TSGP和TSGP亞鐵螯合物干燥后，分別取適量固體樣品和少量干燥的溴化鉀放入瑪瑙研缽中，在紅外燈下充分研磨后，壓至透明薄片，用紅外光譜儀測定其400～4000nm的紅外圖譜。

1.2.10 抗氧化活性的測定 根據文獻[1]測定1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基清除活性及羥自由基（·OH）清除活性[1]，根據文獻[12]測定2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除活性，根據文獻[13]測定血漿鐵還原能力（ferric reduction ability plasma assay，FRAP）[13]。

2 結果與討論

2.1 膠原蛋白提取

用凱式定氮法測得羅非魚皮中的蛋白質含量為26.71%±0.26%。而經熱水提取后的所得的膠原蛋白約占魚皮總重的18.19%，提取率達到了68.10%。

2.2 TSGP的制備

按照1.2.2所述的條件對魚皮膠原蛋白進行水解，所得TSGP水解度為12.35%±0.07%。

對TSGP的氨基酸組成進行分析，結果如表2所示，其中Gly所占比例最大，TSGP氨基酸組成中，每1000個氨基酸殘基含脯氨酸為272.58個，符合膠原蛋白氨基酸的組成特點。

表2 TSGP氨基酸組成及含量分析Table 2 The analysis of TSGP amino acid composition and content

2.3 TSGP亞鐵螯合物的制備

通過前期TSGP亞鐵螯合單因素實驗結果[1]，選定螯合條件：m多肽∶mFeCl2·4H2O=400∶1，pH為6.0，反應時間40min，溫度35℃。以此為基礎設計正交實驗，對TSGP亞鐵螯合物的制備進行優化。由表3分析可知，對實驗結果的影響主次順序為B＞A＞D＞C，即pH對TSGH與亞鐵螯合的影響最大，其次是m多肽∶mFeCl2·4H2O，影響最小的是時間，最佳螯合條件為A3B2C3D2m多肽∶mFeCl2·4H2O= 500∶1，pH為6.0，反應時間50m in，溫度35℃，利用上述螯合條件進行驗證實驗，平行測定3次，亞鐵螯合率達到99.00%。高于表3其他實驗組別的螯合率。

肽的螯合活性與分子量、結構、氨基酸組成以及立體結構有關。TSGP的水解度為12.35%，因此，TSGP的平均分子量在890u左右[14]，適合金屬離子的螯合。研究表明，天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的羧基有利于肽與金屬離子結合，絲氨酸的羥基和巰基可能有助于鐵螯合作用，此外，絲氨酸的磷酸化可以為帶正的金屬如鐵，鈣和鋅創建合適的螯合位點[15]。TSGP中Asp，Glu和Ser含量相對較高，這可能是TSGP具有較高的亞鐵螯合活性的原因之一。

表3 TSGP亞鐵螯合正交實驗結果Table 3 The orthogonal test results of iron-TSGP chelating

2.4 TSGP亞鐵螯合物的表征

2.4.1 TSGP和TSGP亞鐵螯合物成分分析 由表4可知，在定性檢測TSGP亞鐵螯合的過程中，其各個步驟的實驗現象符合多肽螯合物的定性檢測現象。所以可以確定本實驗制備的產品是以多肽螯合物的形式存在的。

由表5可看出，制備的TSGP亞鐵螯合物中主要成分是多肽和鐵，二者質量百分數分別為60.7%和10.24%，但是其中還有較多的鈉鹽的存在，這主要是由于酶解時使用磷酸鹽緩沖液配制膠原蛋白液及調節pH時加入的NaOH或HCI所致，在后續研究中可以通過透析、超濾等方法進一步純化產品。

表5 TSGP和TSGP亞鐵螯合物成分分析Table 5 The componentanalysis of TSGP andiron-TSGP chelate

2.4.2 熒光光譜圖分析 TSGP和TSGP亞鐵螯合物的熒光光譜測定見圖1。圖1（a）顯示了在激發波長289nm時，不同反應時間的熒光發射光譜圖，從圖中可以看出，隨時間的變化，發射光譜有略微紅移的現象，由圖1（b）可以看出10m in之前熒光強度衰減明顯，10min之后的變化不明顯。在蛋白質折疊/展開研究中，熒光強度下降是肽折疊的一個典型指標。根據熒光動力學（圖1b），肽折疊伴隨TSGP亞鐵螯合的全部過程。金屬離子是蛋白質和多肽折疊的關鍵，尤其是對于短肽，其在水溶液中不具有熱力學穩定的結構[5]。

圖1 TSGH亞鐵螯合熒光光譜圖Fig.1 The fluorescence emission spectra of the iron-TSGP chelating

2.4.3 紫外掃描分析 如圖2所示，TSGP和TSGP亞鐵螯合物最大紫外吸收峰對應波長分別為213nm和205nm，最大吸收峰發生位移。螯合物的生成會使其配位體對光吸收性能發生改變，這是TSGP和鐵結合后相應原子的價電子躍遷不同的反映，證明了它們之間發生了螯合反應[7]。

2.4.4 紅外光譜分析 如圖3所示，對TSGP的紅外光譜（A），在特征區，—NH2的吸收峰在3448cm-1；在指紋區，C=O的吸收峰在1652cm-1，-COO-的吸收峰在1407cm-1。TSGP亞鐵螯合物紅外光譜圖（B），在特征區，—NH2的吸收峰移動到了3413cm-1，發生了變化，說明螯合物中的—NH2鍵發生了化學反應；在指紋區，C=O的吸收峰紅移至1660cm-1，-COO-的吸收峰移至1402cm-1，可見，-COO-鍵也發生了的化學反應，表明氨基和羧基均參與了亞鐵的螯合反應。特別地，對于螯合物，在1100cm-1左右出現了的（PtNH2）單吸收峰變成雙吸收峰，也證明Fe2+與-NH2有較強結合。由紅外吸收峰的偏移或變化進一步證實TSGP和Fe2+之間形成了螯合物[7]。

表4 TSGP亞鐵螯合物定性檢測結果Table 4 The qualitative test results of iron-TSGP chelate

圖2 TSGP和TSGP亞鐵螯合肽的紫外吸收曲線Fig.2 Ultravioletabsorption curve of TSGP and iron-TSGP chelate

圖3 TSGP和TSGP亞鐵螯合肽的紅外光譜對比分析Fig.3 Infrared spectrum analysis of TSGP and iron-TSGP chelate

2.4.5 抗氧化活性測定 由表6可以看出，除羥自由基清除活性外，螯合物DPPH自由基清除活性、ABTS+自由基清除活性、FRAP都明顯優于TSGP，螯合物羥自由基清除活性較弱，可能是因為在過渡金屬離子（Fe2+）存在的條件下，超氧陰離子和過氧化氫可以產生羥自由基，使得螯合物對羥自由基的清除活性弱于TSGP。

表6 TSGP和TSGP亞鐵螯合物抗氧化活性的比較Table 6 The comparison of antioxidantactivity of TSGP and iron-TSGP chelate

3 結論

通過正交實驗優化得出TSGP最佳螯合反應條件為m多肽∶mFeCl2·4H2O=500∶1，pH為5.5，反應時間50m in，溫度35℃。通過熒光光譜、紫外光譜和紅外光譜等手段對TSGP亞鐵螯合物的結構進行研究，證實Fe2+和TSGP的羧基與氨基均發生配位反應，TSGP和Fe2+形成了螯合物。通過對TSGP亞鐵螯合物的抗氧化活性進行分析，發現除羥自由基清除活性外，螯合物DPPH自由基清除活性、ABTS+自由基清除活性、FRAP都明顯優于TSGP，說明TSGP亞鐵螯合物可作為一種潛在的抗氧化劑。

[1]Zhang Yufeng，Duan Xiu，Zhuang Yongliang.Purification and characterization of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of tilapia（Oreochromis niloticus）skin gelatin[J]. Peptides，2012，38（1）：13－21.

[2]Raghavan Sivakumar，Kristinsson Hordur G.ACE-inhibitory activity of tilapia protein hydrolysates[J].Food Chemistry，2009，117（4）：582－588.

[3]王靜鳳，王奕，崔鳳霞，等.魷魚皮膠原蛋白多肽對B16黑素瘤細胞黑素合成的影響[J].中國藥理學通報，2007，23（9）：1181－1184.

[4]Ravallec-PléRozenn，Wormhoudt Alain Van.Secretagogue activities in cod（＜i＞Gadusmorhua＜/i＞）and shrimp（＜i＞Penaeus aztecus＜/i＞）extractsand alcalase hydrolysates determined in AR4-2J pancreatic tumour cells[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology，2003，134（4）：669－679.

[5]Wu Haohao，Liu Zunying，Zhao Yuanhui，et al.Enzymatic preparation and characterization of iron-chelating peptides from anchovy（Engraulis japonicus）muscle protein[J].Food Research International，2012，48（2）：435－441.

[6]趙洪雷，徐永霞，楊杰，等.低值魚小肽螯合鋅的制備工藝研究[J].食品科技，2009，34（9）：117－119.

[7]夏光華，申鉉日，酒志強.羅非魚皮膠原蛋白小肽螯合鈣的制備、鑒定及抗氧化研究[J].食品科技，2013，38（6）：242－246.

[8]王琳芳，楊克恭.蛋白質與核酸[M].北京：北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社，1999：1－18.

[9趙新淮，馮志彪.大豆蛋白水解物水解度測定的研究[J].東北農業大學學報，1995，26（2）：178－180.

[10]Eun Young Park，Hiroko Imazu，Yasuki Matsumura，et al. Effects of Peptide Fractionswith Different Isoelectric Points from Wheat Gluten Hydrolysates on Lipid Oxidation in Pork Meat Patties[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（30）：7483－7488.

[11]吳茹怡，曾里，曾凡駿.復合氨基酸螯合物鑒定方法的研究[J].食品科技，2006（3）：104－110.

[12]夏光華，申鉉日，蔡錦紅.三酶法制備羅非魚魚皮膠原蛋白抗氧化肽及活性研究[J].食品科學，2012，33（23）：175－179.

[13]陳力宏，董英，陸炳，等.酶法制備蠶繭層抗氧化活性肽的工藝條件研究[J].食品研究與開發，2013，34（6）：5－10.

[14]張宇昊，王強.Alcalase酶水解花生蛋白制備花生短肽的研究[J].農業工程學報，2007，23（4）：258-262.

[15]Lidong Guo，Hu Hou，Bafang Li，et al.Preparation，isolation and identification of iron-chelating peptides derived from Alaska pollock skin[J].Process Biochemistry，2013，48（5－6）：988－993.

Preparation，characterization and antioxidant activity of tilapia skin collagen polypeptides chelated iron

DUAN Xiu，YANG Cheng-tao，SUN Yun，SUN Li-ping*，ZHUANG Yong-liang
（Research Centre of Food Engineering，College of Chemistry and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

Tilap ia skin collagen polypep tides（TSGP）was p repared and chelated by iron.The physical，chem ical and functional p roperties of the chelate were characterized.The op timum parameters of chelating as follows：mpolypeptides∶mFeCl2·4H2O=500∶1，pH6.0，reaction time 50m in，temperature 35℃.The formation of iron-TSGP chelate was confirmed by the Ultraviolet spectrum and Infrared spectroscopy，and found that the carboxyl and am ino group of TSGP bounded w ith iron.In add ition，chelate had a strong radical scavenging activities of DPPH·and ABTS+·.

tilap ia skin；TSGP；chelate；structure；antioxidantactivity

TS201.1

A

1002-0306（2014）18-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.025

2013－11－07 *通訊聯系人

段秀（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品營養與安全。

國家自然科學基金項目（31101392）。