甲基綠褪色分光光度法測定紅霉素

陳蓮惠 葉 莉 謝 夢

(1川北醫學院化學教研室，四川 南充 637000； 2川北醫學院藥學院，四川 南充 637000)

0 引言

紅霉素常用于對青霉素耐藥的革蘭陽性細菌感染及對青霉素過敏的患者，對肺炎、扁桃體炎等很多炎癥有很好的療效。已報道的紅霉素測定方法有高效液相色譜法[1]、微生物檢測法[2]、電荷轉移分光光度法[3]、電化學方法[4]、比濁法[5]等。這些方法都有優缺點。紅霉素在中性條件下能與甲基綠反應生成締合物，較甲基綠的吸光度有明顯降低，在635 nm附近測定其吸光度降低值，發現吸光度的降低值與紅霉素的濃度成正比，由此我們建立了測定紅霉素的褪色分光光度法。與其它測定紅霉素的方法相比，該法簡便可靠，重現性和選擇性較好。文中還探討了反應和測定的最佳條件。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

721分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；電熱恒溫水槽-DKB-S420(臺灣斯特儀器設備有限公司)；PHS-3C酸度計(上海儀電科學儀器有限公司)；ML104電子天平(杭州匯爾儀器設備有限公司)。

磷酸，冰乙酸，無水乙醇，硼酸，氫氧化鈉均為分析純；實驗用水皆為二次蒸餾水；紅霉素標準樣品(Erythromycin，中國藥品生物制品檢定所)，甲基綠標準樣品(Methyl Green，成都科龍化工試劑廠)，紅霉素腸溶片(吉林省長恒藥業有限公司)，紅霉素腸溶片(輔仁藥業集團公司)。

1.2 實驗方法

紅霉素標準儲備溶液：準確稱取紅霉素標準樣品100.2 mg，用無水乙醇配制成50.00 mL的標準儲備溶液，使用時用水稀釋為0.1 mg/mL的標準工作溶液。

甲基綠溶液(3.29×10-4mol/L)：準確稱取甲基綠標準品0.10 g配制成500.00 mL水溶液，搖勻，使用時稀釋為1.64×10-4mol/L的工作溶液。

1.3 實驗操作

準確移取4.00 mL紅霉素標準工作溶液于15.00 mL比色管中，再加入甲基綠工作溶液4.00 mL，用水稀釋至刻度并搖勻，40 ℃恒溫水槽中水浴加熱20 min，冷卻至室溫，試劑空白作參比，在635 nm處測定吸光度。

2 實驗結果與討論

2.1 檢測波長

按照實驗方法反應后，分別對紅霉素溶液、甲基綠溶液和甲基綠-紅霉素混合溶液進行吸光度測定。結果如圖1顯示：在可見光區紅霉素溶液幾乎對光無吸收；甲基綠卻有強烈的吸收，且最大吸收波長在635 nm附近；甲基綠和紅霉素的混合溶液有吸收，但較甲基綠有明顯褪色，褪色最明顯時對應的波長為635 nm，故選635 nm為測定波長。

圖1 吸收光譜(以水作參比)Figure 1 Absorption spectra (against water).

2.2 反應條件選擇

2.2.1 稀釋劑

實驗了水、甲醇、乙醇作溶劑定容時對顯色反應的影響。結果顯示，無論用何種溶劑作稀釋劑對實驗結果均無明顯影響。本實驗選用水作稀釋劑。

2.2.2 緩沖溶液

實驗了HAc-NaAc，B.R.，Tris-HCl，H2PO4--HPO42-等幾種常見的緩沖溶液對實驗體系吸光度的影響，結果顯示：有氫氧化鈉參與配制的緩沖溶液讓體系褪色更為明顯，進一步實驗證明是甲基綠在氫氧化鈉溶液中顯示無色，與紅霉素存在與否沒有任何關系；在弱酸性HAc-NaAc緩沖溶液中，體系顏色加深了，在測定范圍內檢測到體系吸光度值均比不加緩沖溶液時要小，誤差變大。故本實驗不加緩沖溶液。

2.2.3 顯色劑用量

按照實驗方法，加入2.00，4.00，6.00，8.00 mL等不同用量的甲基綠工作溶液，測定吸光度，結果顯示：當顯色劑用量為6.00 mL以上時，相對吸光度不再明顯增加。本實驗選用4.00 mL。

2.2.4 反應溫度

按照實驗方法，將配制好的相同濃度的11個混合溶液分別置于0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 ℃等不同溫度的水浴中恒溫20 min，冷卻(或升溫)到室溫，用試劑空白作參比分別測定各溶液吸光度。結果表明，40 ℃下的反應液吸光度差值最大，故選擇40 ℃為體系的反應溫度。

2.2.5 顯色時間

按照實驗方法，將最佳反應條件下的體系加熱反應20 min后冷卻至室溫，放置5，10，15，20，25，30，40，50 min；1，1.5，2，3 h后進行測定。結果顯示：各個時間點測得的吸光度基本一致，即使將體系放置6 h后再測定，吸光度變化值也不超過±5%，可見體系穩定性好。

2.2.6 干擾實驗

在最佳測試條件下，考察了常見維生素、無機鹽離子、8種氨基酸、糖類等共存物質對體系吸光度的影響。實驗結果如表1所示：Bi3+，Re3+，四環素和強力霉素等有一定干擾，而較大倍數的Na+，Cl-，K+，I-，H2PO4-，HCO3-等大多數無機離子和一定量的氨基酸、糖類均不干擾。加標回收實驗(表2)也顯示藥物中的輔料對測定幾乎無影響。

表1 共存物質的影響(紅霉素腸溶片溶液：0.067 mg/mL) Table 1 Interferences of the coexisting substances(CErythromycin is 0.067 mg/mL)

2.3 工作曲線和參數

用移液管移取一系列不同體積的紅霉素工作液于一系列15.00 mL比色管中，按實驗方法加入甲基綠溶液，在最佳反應條件下反應完全，測定吸光度差值，將吸光度差值縱坐標、紅霉素濃度為橫坐標繪制工作曲線。結果表明：紅霉素的濃度在0.000 6～0.105 0 mg/mL范圍內有很好的線性關系，服從Beer定律，線性回歸方程為：A=-7.41c+0.025 9，r=0.999 2；對15.00 mL 5.0×10-3mg/mL紅霉素測定6次，RSD=0.8%。方法的檢出限為0.26 μg/mL。表觀摩爾吸光系數ε為4.23×104L/(mol·cm)-1。

2.4 樣品測定

取兩個不同廠家的紅霉素腸溶片各4片，按照2010版藥典，在研缽中研細，用無水乙醇50 mL分次研磨使紅霉素腸溶片溶解，定量轉移到500.00 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容，搖勻，靜置。實驗時精密量取上清液適量在最佳實驗條件下進行測定。同時往樣品中加入已知量的紅霉素標準品(加入量為4.00 μg/mL)進行加標回收實驗，結果見表2。由此可知：用所建立的褪色光度法測定紅霉素腸溶片中的紅霉素，測定值與正規廠家生產及標示的含量基本一致；加標回收實驗顯示該法的穩定性和重現性較理想。

表2 樣品測定與加標回收實驗結果 Table 2 Analytical results of samples and recovery tests (n=6)

3 結語

通過甲基綠和紅霉素反應前后吸收光譜研究和條件實驗，我們建立了一種測定紅霉素的褪色分光光度法。用所建立的褪色光度法測定紅霉素腸溶片中的紅霉素，測定值與正規廠家生產及標示的含量基本一致；方法簡便快捷、檢測限低，加標回收實驗顯示該法的穩定性和重現性較理想，可用來測定紅霉素腸溶片中的紅霉素含量。

[1] 于慧娟,蔡友瓊,顧潤潤.高效液相色譜法測定紅霉素、甲紅霉素和羅紅霉素的研究[J].分析實驗室,2006,25(6)：63-66.

[2] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].2010版.北京：化學工業出版社,2010,301.

[3] 李春香,徐婉珍,閆永勝.結晶紫-紅霉素體系電荷轉移分光光度法測定紅霉素的研究[J].藥物分析雜志,2006,26(12)：1737-1739.

[4] Helena T,Britt-maric E.Determination of erythromycin in gastric-juice and blood plasma by liquid chromatography and electrochemical detection[J]. J Chromatogr B, 1995,673：81.

[5] 劉珂.比濁法自動測定紅霉素及紅霉素腸溶片的效價[J].中國藥品標準,2010,11(3)：204-206.