石漠化地區豆科植物根瘤菌降解碳酸鈣、鎂能力研究

王明月，劉紹雄，熊智，丁雅迪，王艷玲，李克艷，陽廷丹，陶茜，王金華*

1. 西南林業大學，西南山地森林資源保護與利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223

石漠化地區豆科植物根瘤菌降解碳酸鈣、鎂能力研究

王明月1，劉紹雄2，熊智1，丁雅迪1，王艷玲1，李克艷1，陽廷丹1，陶茜1，王金華1*

1. 西南林業大學，西南山地森林資源保護與利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223

微生物對巖溶地區巖石風化、成土具有明顯的促進作用，為了篩選出能夠促進碳酸鹽巖風化、加快成土速率的優勢根瘤菌菌株，將其與豆科植物建立共生體系，進行石漠化地區修復與治理，實驗以分離自云南石漠化地區的9株豆科植物根瘤菌為研究對象，將9株根瘤菌接種于加有難溶性碳酸鈣或碳酸鎂的液體培養液中，28.5 ℃、160 r·min-1搖床培養15 d，于0、1、3、6、10、15 d取樣2 mL，每個樣3個平行；將樣品加入到10 mL體積比5∶1的硝酸高氯酸消化液中浸泡過夜，放在電熱板上緩慢加熱至溶液澄清透明，分別用含La3+2%的鹽酸溶液定容至10 mL，空白用同樣方法處理；最后采用原子火焰吸收方法測定樣品中Ca2+和Mg2+含量，篩選出對碳酸鹽巖主要成分碳酸鈣和碳酸鎂具有強降解作用的根瘤菌菌株。結果表明：熱帶根瘤菌Rhizobium tropici (SWFU09)和根瘤菌Rhizobium sp. (SWFU02)對碳酸鈣降解作用最強；對碳酸鎂降解作用最好的菌株為根瘤菌Rhizobium sp.（SWFU03）、熱帶根瘤菌Rhizobium tropici（SWFU05）和慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.（SWFU01）。溶液pH值對碳酸鎂降解作用具重要的影響，對碳酸鈣降解作用影響不大，說明根瘤菌代謝產生的酸性物質（有機酸、氨基酸）對碳酸鈣和碳酸鎂降解作用有一定影響，但不是唯一影響因素；也可能是微生物代謝產生的有機配體（基）吸附碳酸鈣和碳酸鎂表面，與水體中的成分形成復合物，改變溶解的平衡，置換出Ca2+和Mg2+。

根瘤菌；降解作用；碳酸鈣；碳酸鎂

我國是世界上碳酸鹽巖分布面積最大的國家，分布面積大約為130萬km2，占全國陸地總面積的14%，是世界上最大的巖溶區之一。碳酸鹽巖主要由CaMg(CO3)2含量較高的白云巖（mCaCO3：mMgCO3大致為1∶1）和CaCO3含量較高的石灰巖組成（丁麗君，2009；姬飛騰等，2009）。由于碳酸鹽巖地區地形地貌復雜，生態環境脆弱，人類活動范圍擴大和自然環境日趨惡化使該地區地表植被遭受破壞，土壤嚴重流失，出現基石大面積裸露或礫石堆積的巖溶地區土地極端退化的現象，即石漠化（王代懿等，2005；劉映良，2005），被稱為“生態癌癥”。顛、黔、桂三省是我國石漠化最嚴重的地區，石漠化土地面積6.79萬hm2，占3省總面積的18%（郭柯，2011）。近年來石漠化土地面積總體上仍呈擴張趨勢（李陽兵等，2005），石漠化已經成為巖溶地區最大的生態問題，石漠化治理刻不容緩（尹育知，2013）。目前我國在石漠化治理主要采用植被恢復方法，改善石漠化土壤理化性質，減少水土流失。

根瘤菌(Rhizobia)是可與宿主豆科植物共生，形成根瘤并將大氣中的氣態氮固定轉化成銨態氮，能夠顯著促進植物生長，同時還能夠增加土壤肥力，改良土壤結構，改善土壤蓄水，提高土壤抗風蝕力，構建根瘤菌-宿主植物共生體系成為了解決石漠化地區植被恢復問題的主要方式（韋革宏和馬占強，2010）。李建華等（2010）在山西礦區復墾土壤上種植接種根瘤菌的白三葉草（Trifolium repens L.），結果表明接種根瘤菌能顯著提高植物生物量和土壤養分利用率，表明豆科植物因可以與根瘤菌共生固氮而克服退化土壤瘦瘠所帶來的障礙，是解決復墾退化土壤中養分缺乏的有效措施。劉曉光等（2006）在內蒙古武川旱農的大田試驗發現，對風蝕退化土壤接種根瘤菌能夠明顯促進團聚體形成，改良土壤結構，提高抗風蝕能力，增加土壤肥力，改善蓄水狀況。上述方法是針對巖溶地區已覆蓋土壤進行研究，而石漠化問題的關鍵點在于石漠化地區少土多石，加快石漠化地區巖石風化成土速率，擴大土壤覆蓋面積和增加土層厚度才是解決石漠化現狀的最主要手段，目前關于這一方面的研究較少。大量研究表明微生物對巖溶地區巖石風化、成土具有明顯的促進作用（連賓等，2008；連賓等，2011）。本文以建立豆科植物-根瘤菌共生體系的基礎上，進一步篩選出對碳酸鹽巖具有一定作用，能夠促進碳酸鹽巖風化，加快成土速率的優勢根瘤菌菌株,為進一步探索石漠化修復和治理提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗用豆科植物根瘤菌由西南林業大學生命科學學院王金華副教授提供。菌株種屬鑒定以及與豆科植物的寄主關系如表1。

1.2 儀器與試劑

儀器：恒溫搖床培養儀、離心機（Sorvall R RC-3BP）、紫外-可見分光光度計、無菌操作臺、1000 mL移液器、筆式pH測定儀（PH600）、250 mL錐形瓶、原子吸收分光光度計990F。

YMA（解鈣）：甘露醇10 g，K2HPO40.25 g，KH2PO40.25 g，MgSO40.2 g，Nacl 0.1 g，Yeast 0.8 g，CaCO350 g，加去離子水至 1 L，pH 6.8～7.2。

YMA（解鎂）：等量MgCO3代替CaCO3，其他物質含量相同。

1.3 種子液、對照及發酵液的制備

1.3.1 種子液制備

將純化好的SWFU01菌種轉接于已滅菌的裝有100 mL PDA（丁麗君和連賓，2008）培養基的250 mL三角瓶中，28.5 ℃，160 r·min-1恒溫搖床培養3～5 d，制備SWFU01菌液，相同方法制備其他8種菌液。將制備的9種菌液進行分光光度法測定OD值，最后用去離子水將9種菌液稀釋成相同OD值作為種子液。

1.3.2 對照及發酵液的制備

純水對照（對照1）：在250 mL三角瓶中加入100 mL去離子水，滅菌后加入已滅菌的碳酸鈣（或碳酸鎂）5 g和3 mL去離子水。

培養基對照（對照2）：在250 mL三角瓶中加入PDA培養液100 mL，滅菌后加入已滅菌的碳酸鈣（或碳酸鎂）5 g和3 mL PDA培養液。

活菌發酵液處理：在250 mL的三角瓶中加入PDA培養液100 mL，滅菌后加入已滅菌的碳酸鈣（或碳酸鎂）5 g，隨后接入3 mL SWFU01菌液，同樣方法處理其他8種菌液。將對照和各菌發酵液放入恒溫搖床（28.5 ℃，160 r·min-1）中培養，分別在0、1、3、6、10、15 d取樣，各3個平行，經10000 r·min-1的高速離心30 min，取上清液通過細菌濾膜（孔徑：0. 45 mm）過濾備用。

1.4 碳酸鈣和碳酸鎂風化程度及發酵液PH值測定

將樣品加入10 mL的體積比5∶1的硝酸高氯酸消化液中浸泡過夜，放在電熱板上緩慢加熱至溶液澄清透明，取下放至室溫，分別用含La3+2%的鹽酸溶液定容至10 mL，空白用同樣方法處理；取前述處理所得的溶液液，用去離子水配成體積比為99∶1的溶液，以原子吸收分光光度計( PE5100PC )測Ca2+（Mg2+）含量，以溶液中Ca2+(Mg2+)含量作為CaCO3（MgCO3）風化程度的指標。用精密酸度計(pH600)同樣條件下測定培養15 d的9種菌液和對照樣品pH值。

2 結果與分析

2.1 石漠化根瘤菌對碳酸鈣降解作用能力的差異和規律

由圖1表明，9株根瘤菌對碳酸鈣的降解能力存在一定的差異。SWFU09 和SWFU02降解作用最強，SWFU09在培養7 d后Ca2+質量濃度達到430 mg·L-1，7 d后Ca2+質量濃度仍小幅度增長；SWFU02在10 d達到最大降解能力，Ca2+質量濃度達到230 mg·L-1。SWFU07和SWFU08降解能力次之。SWFU03、SWFU04、SWFU05、SWFU06降解作用極弱或沒有降解作用。圖中亦可看出9株根瘤菌在搖床培養3 d時均出現了極小值點，隨后又均出現了不同程度的降解能力的上升情況?？赡苁且驗樵?～1 d時培養基中的碳酸鈣經振蕩培養，使Ca2+質量濃度輕微上升，2～3 d微生物呼吸作用釋放CO2與培養液中游離態OH-、Ca2+結合生成難溶物碳酸鈣，使Ca2+質量濃度輕微下降，第3 d時Ca2+質量濃度降至極小值點，3～10 d根瘤菌處于對數生長期，菌株的生長速率最快、代謝旺盛、酶系活躍，釋放出大量的酶及有機酸類物質，導致碳酸鈣溶解，使Ca2+質量濃度迅速上升；10～15 d，菌株的生長處于穩定期，對碳酸鈣降解能力下降，碳酸鈣達到溶解平衡，所以Ca2+質量濃度趨近于平穩不變。

表1 根瘤菌種屬及其宿主Table 1 Rhizobia species identification and hosts

圖1 根瘤菌對碳酸鈣的降解作用Fig. 1 Rhizobia strains for the degradation of calcium carbonate

由表2可知，9株菌在15 d時pH由大到小順序為SWFU04＞ 純水對照＞ SWFU02＞ 培養基對照＞ SWFU 07＞ SWFU05＞ SWFU08＞ SWFU01＞SWFU03＞ SWFU09＞ SWFU06；而菌株對碳酸鈣的降解速率由大到小順序為：SWFU09＞SWFU02＞SWFU07＞SWFU08＞SWFU01＞SWFU03＞SWFU04＞SWFU05＞SWFU06，同時通過表2亦可發現SWFU09和SWFU02在培養15 d中pH呈上升趨勢，SWFU06的pH降低，根據酸性條件碳酸鈣降解效率，SWFU06的效率應該最強，但降解效率最強的是SWFU09和SWFU02，結果說明根瘤菌代謝產生可降低pH的酸性物質對碳酸鈣降解作用有影響，但不是唯一影響因素。

表2 不同菌株在PDA培養液搖床15 d內的pH值Table 2 pH changes of cultur with inoculated calcium carbonat degradation rhizobium in 15 d

2.2 石漠化根瘤菌對碳酸鎂降解作用能力的差異和規律

由圖2表明，3株根瘤菌對碳酸鎂的降解作用較好，降解能力分別為SWFU03＞SWFU05＞SWFU01，最大降解能力分別為834、680和632 mg·L-1；其余6株根瘤菌也表現出一定的降解作用，最弱的為SWFU02菌株。同時可以看出，根瘤菌對碳酸鎂的降解規律曲線與對碳酸鈣的降解規律曲線存在一定的差異，在搖床培養3 d時并未出現凹槽，而是在6 d處SWFU02、SWFU04、SWFU06三株菌出現凹槽，其余菌株未出現。分析原因可能是因為：在0 d，Mg2+質量濃度為380 mg·L-1（圖2），高質量濃度Mg2+對根瘤菌的生長起到了抑制作用，延遲了對數生長期的到來。在4～6 d，培養基pH值升高顯弱堿性（表2），Mg2+與OH-反應生成Mg(OH)2，同時5～6 d菌株也開始進入對數生長期，對碳酸鎂的降解速率加快，同時微生物生長分泌的有機酸等物質中和了培養液中OH-，溶液pH值降低，Mg(OH)2生成量減少，菌株的降解速率與Mg(OH)2的生成速率之差決定了凹槽是否出現。

由表3可知在15 d時，菌株pH值由大到小順序：SWFU02＞ SWFU06＞ SWFU08＞ SWFU09＞ 培養基對照＞ SWFU04＞ SWFU07＞ SWFU01＞SWFU03＞ SWFU05＞ 純水對照；菌株對碳酸鎂的降解能力大小順序為SWFU03＞ SWFU05＞SWFU01＞SWFU07＞SWFU09＞SWFU04＞SWFU06＞SWFU02，結果說明根瘤菌代謝產生酸性物質對碳酸鎂降解作用有重要影響。

圖2 根瘤菌對碳酸鎂的降解作用Fig. 2 Rhizobia strains for the degradation of magnesium carbonate

表3 接種根瘤菌的降解碳酸鎂培養液搖床15 d內pH值變化Table 3 pH changes of the culture with inoculated magnesium carbonate degradation rhizobium in 15 d

3 結論與討論

3.1 結論

9株豆科植物根瘤菌中，對碳酸鈣效降解作用最強的菌株為熱帶根瘤菌Rhizobium tropici（SWFU09）和根瘤菌Rhizobium sp.（SWFU02）；對碳酸鎂降解作用效果最好的菌株為根瘤菌Rhizobium sp.（SWFU03）、熱帶根瘤菌Rhizobium tropici（SWFU05）和慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.（SWFU01）。溶液pH值對碳酸鎂降解作用呈負相關，說明根瘤菌代謝產生的有機酸等酸性物質對碳酸鎂降解作用有重要影響；溶液pH值對碳酸鈣降解作用影響不大，說明根瘤菌代謝產生的有機酸等酸性物質對碳酸鈣降解作用有一定影響，但不是唯一影響因素。碳酸鈣和碳酸鎂的降解作用也可能與微生物代謝產生的有機配體（基）有關，有機配體（基）吸附碳酸鈣和碳酸鎂表面，與水體中的成分形成復合物，改變溶解的平衡，置換出Ca2+和Mg2+；微生物代謝產生的酶也可影響降解；酶和酚類代謝產物也可能具有一定的影響，需要進一步深入的研究。

3.2 討論

微生物生長過程中的直接或間接作用，如：微生物可分泌有機酸、無機酸、聚合物，并改變環境的pH、Eh值及氧化還原環境，加速礦物的溶解，促進碳酸鹽巖風化（Laura等，2000；Kalinowski等，2000）；真菌吸附作用和菌絲的機械作用對碳酸鹽巖風化能力強弱的也具有一定的影響（周躍飛等，2009；竇傳偉和連賓，2009）；同時，細菌對碳酸鹽巖風化可能還與特殊的蛋白質或酶密切相關（連賓等，2011），諸多研究說明了微生物對碳酸鹽巖風化具有重要影響。本研究篩選出來的根瘤菌菌株對碳酸鈣、碳酸鎂具有不同程度的強降解作用，將其運用到石漠化地區的治理過程中，在石漠化地區種植與此根瘤菌共生的豆科植物，形成豆科植物-根瘤菌共生體系，可降解石漠化地區碳酸鹽巖中高含量的難溶性鈣、鎂，但Ca2+和Mg2+是植物生長所需的微量元素，只有保持適宜低濃度水平才能發揮其正常生理功能。鈣離子濃度超過最適濃度時，會使植物細胞的伸長受到抑制；過量的鈣離子將會同磷酸鹽反應生成沉淀，干擾植物的磷酸代謝體系和以磷酸為基礎的能量代謝，絕大多數植物對土壤中鈣離子的吸收與土壤離子濃度呈正相關，因此篩選出最適宜的鈣鎂降解菌株具有重要意義（羅緒強等，2012）。在石漠化地區建立根瘤菌-豆科植物共生體系時，我們同樣需要面臨的嚴峻問題是石漠化地區土壤貧瘠，豆科植物生長必須的營養元素匱乏，豆科植物生長成活率低。連賓對含鉀巖石微生物轉化的研究中發現，解鉀微生物具有促進鉀巖石風化以及促進巖石中以難溶性狀態存在的Ca、K、Al、Fe在巖石中的溶出（劉殿鋒，2014）。在石漠化治理方法的研究中，可對已經分離自石漠化地區豆科植物的根瘤菌進行進一步研究，獲得對碳酸鹽巖及周圍土壤中難溶性或難利用的Al、Fe、P、K等微量元素具有溶解作用或對微量元素具有富集作用的根瘤菌菌株，改善石漠化地區植物生長環境，為植物生長提供適宜的環境，建立有效的豆科植物-根瘤菌共生體系提供理論研究基礎，為探索更加行之有效的石漠化修復和治理方法提供基礎依據。

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Leguminous Plants Rhizobia Degradation of Calcium Carbonate and Magnesium Carbonate

WANG Mingyue1, LIU Shaoxiong2, XIONG Zhi1, DING Yadi1, WANG Yanlin1, LI Keyan1, YANG Tingdan1, TAO Xi1, WANG Jinhua1*

1. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China；2. Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooporatives, Kunming 650223, China

Microorganism played an obvious role in facilitating the reaction rate of rock weathering and soil formation, in order to attain dominant rhizobium strains promoted the rock weathering and speed up the rate of soil rhizobium, the dominant rhizobium strains established the symbiotic system with leguminous plants to repair and manage the rocky desertification areas, the thesis studied on the 9 strains from leguminous plants rhizobia by the test of doing the strains in liquid medium with difficult soluble calcium carbonate or magnesium carbonate, then, handled with 28.5 ℃, 160 r·min-1and 15 d table culture, sampled 2 ml of three at 0, 1, 3, 6, 10, 15 d. Samples added into the 10 mL digestive juices for a night, nitric acid and perchloric acid volume ratio was 5 to 1 of the digestive juices, heating Slowly, get clear solutions, the capacity to 10 mL by adding 2% hydrochloric acid solution which contain La3+,the same do with blank，used the flame atomic absorption method to determin contents of Ca2+and Mg2+in the samples parallel. We eagered to obtain the certain strains had strong degradation of calcium carbonate or magnesium carbonate. The results showed that the best calcium carbonate degradation strains were Rhizobium tropici (SWFU09) and Rhizobium sp. (SWFU02), the best strains of magnesium carbonate degradation were Rhizobium sp. (SWFU03), Rhizobium tropici (SWFU05) and Bradyrhizobium sp. (SWFU01). The solution pH had an important influence on degradation of magnesium carbonate, but not obvious on calcium carbonate degradation. We could have a conclusion: acid producted by microbial metabolism had a certain influence on degradations of calcium carbonate and magnesium carbonate, but it was not the only factor. Organic ligand (base) also producted by microbial metabolism might adsorpt on calcium carbonate or magnesium carbonate surface, it could form compounds with ingredients in the water, change the balance of dissolution, Ca2+and Mg2+were replaced.

rhizobia; degradation; calcium carbonate; magnesium carbonate

Q933

A

1674-5906（2014）10-1581-05

王明月，劉紹雄，熊智，丁雅迪，王艷玲，李克艷，陽廷丹，陶茜，王金華. 石漠化地區豆科植物根瘤菌降解碳酸鈣、鎂能力研究[J]. 生態環境學報, 2014, 23(10): 1581-1585.

WANG Mingyue, LIU Shaoxiong, XIONG Zhi, DING Yadi, WANG Yanlin, LI Keyan, YANG Tingdan, TAO Xi, WANG Jinhua. Study on leguminous plants rhizobia degradation of calcium carbonate and magnesium carbonate [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(10): 1581-1585.

國家基金（31100007）；云南省教育廳基金（2012Z068）

王明月（1987年生），女，碩士研究生，研究方向微生物生理學。E-mail：821107119@qq.com

*通信作者：王金華（1976年生），女，副教授。E-mail：46639881@qq.com

2014-07-24