響應面法優(yōu)化紅緣擬層孔菌胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基

圣志存，郝利民，2，*，賈士儒，陶如玉，張 虹，魯吉珂

（1.天津科技大學，工業(yè)發(fā)酵微生物重點實驗室，天津300457；2.總后勤部軍需裝備研究所，北京100010；3.武裝警察部隊總部機關(guān)門診部，北京100089；4.鄭州大學生命科學學院，河南鄭州450001）

響應面法優(yōu)化紅緣擬層孔菌胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基

圣志存1，郝利民1，2，*，賈士儒1，陶如玉1，張 虹3，魯吉珂2，4

（1.天津科技大學，工業(yè)發(fā)酵微生物重點實驗室，天津300457；2.總后勤部軍需裝備研究所，北京100010；3.武裝警察部隊總部機關(guān)門診部，北京100089；4.鄭州大學生命科學學院，河南鄭州450001）

為提高紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）胞外多糖（EPS）產(chǎn)量，采用響應面法對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用中心組合設計原理，以蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O濃度為實驗因素，以多糖產(chǎn)量為響應值，采用3因素5水平響應面分析方法建立數(shù)學模型。結(jié)果顯示，紅緣擬層孔菌產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)基為：蔗糖186g/L、酵母粉7g/L，MgSO4·7H2O 27g/L，KH2PO42g/L。在此條件下，EPS產(chǎn)量預測值為4.02g/L，驗證值為（3.92±0.18）g/L。采用響應面法對紅緣擬層孔菌EPS發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，方法可行。

紅緣擬層孔菌，紅緣擬層孔菌胞外多糖，響應面

紅緣擬層孔菌又名紅緣層孔菌、紅緣樹舌、紅帶菌等[1]，為世界廣泛分布的木腐真菌，生長在多種針葉樹、闊葉樹立木、倒木及腐朽木上，在我國東北地區(qū)常作為藥用補肺益腎，鎮(zhèn)痛解毒等。現(xiàn)代藥理研究表明，該菌提取物具有抗菌、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、增強免疫力、保護肝損傷、抑制腫瘤細胞和清除自由基等作用[2-5]。當前藥用真菌活性物質(zhì)幾乎都來源于子實體，其生長狀況及產(chǎn)量完全受自然條件的控制，野生菌難以滿足人們的需求。紅緣擬層孔菌液體培養(yǎng)有望解決子實體生長周期長和自然資源稀少的問題，值得進一步深入研究。目前，對紅緣擬層孔菌的研究主要集中在菌絲體培養(yǎng)、胞內(nèi)多糖及其活性研究等方面[6]，而對以胞外多糖為目標產(chǎn)物的紅緣擬層孔菌發(fā)酵培養(yǎng)基的研究尚未見報道。

培養(yǎng)基成分是影響紅緣擬層孔菌胞外多糖（EPS）產(chǎn)量的主要因素，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化是提高EPS產(chǎn)量的有效途徑。響應面分析法通過合理設計實驗，建立二次回歸模型，對各因子水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價，尋求最優(yōu)響應因子水平及響應值，可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[7-11]。本文通過單因素和響應面分析實驗優(yōu)化胞外多糖產(chǎn)量適宜的培養(yǎng)基，可為后續(xù)紅緣擬層孔菌EPS的藥用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）菌種由總后勤部軍需裝備研究所提供；種子培養(yǎng)（g/L） 葡萄糖30，酵母粉5，KH2PO42，MgSO4·7H2O 10，pH6.0；酵母粉 天津市百世化工有限公司；蛋白胨 天津市化學試劑一廠；麥芽糖 海藍季科技發(fā)展有限公司；乳糖 天津市德恩化學試劑有限公司；蔗糖、NaNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4、（NH4）2SO4、NH4Cl天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；以上試劑等級均為分析純。

RE-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；QL-902型漩渦振蕩器 海門市其林儀器制造有限公司；722s型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限責任公司；UV-3600型紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 液體菌種制備 取3～4塊約0.5～1.0cm2的菌種塊接種到盛有150mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)48h，得液體菌種。

1.2.2 液體培養(yǎng) 500mL三角瓶中分裝135mL發(fā)酵培養(yǎng)基，10%接種量接種，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)5d，得液體發(fā)酵液。

1.2.3 EPS提取及測定 取發(fā)酵液5mL加入3倍體積95%乙醇，4℃靜置過夜。10000r/min，離心10min，收集沉淀。用65℃溫水溶解，定容，苯酚硫酸法測EPS含量[12]。

1.3 實驗設計

首先利用單因素實驗篩選對紅緣擬層孔菌EPS產(chǎn)量影響顯著的因素，再利用部分因子實驗和最陡爬坡實驗確定對EPS產(chǎn)量較為顯著的變量和其最佳濃度中心點，最后利用中心組合設計實驗對紅緣擬層孔菌EPS發(fā)酵培養(yǎng)基進行預測和驗證。

1.3.1 單因素實驗

1.3.1.1 碳源實驗 分別以3%（w/v）的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖為碳源，酵母粉0.5%，MgSO4·7H2O 1.0%，KH2PO42g/L培養(yǎng)紅緣擬層孔菌5d，考察碳源對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.1.2 氮源實驗 分別以0.5%的酵母粉、蛋白胨、NaNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4為氮源，蔗糖5%，MgSO4·7H2O 1.0%，KH2PO42g/L培養(yǎng)紅緣擬層孔菌5d，考察碳源對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.1.3 無機鹽實驗 分別以5%的蔗糖，1%的酵母粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4的添加量篩選對EPS產(chǎn)量的影響較大的無機鹽，再對其濃度進行優(yōu)化。

1.3.2 部分因子設計實驗 分別選取以上4個因素的高低2個水平，通過Design Expert軟件的部分因子設計，以EPS產(chǎn)量作為響應值。通過比較各因素的顯著性水平，篩選出對EPS產(chǎn)量影響較為顯著的因素。表1為部分因子實驗設計水平及其編碼值。

表1 部分因子實驗設計及其編碼水平Table.1 The experiment design and coded level of fraction factor design

1.3.3 最陡爬坡實驗 最陡爬坡實驗以部分因子實驗的中心點為路起始點向外延伸，由回歸方程確定正負效應來增加或降低變量濃度。根據(jù)部分因子實驗及其分析結(jié)果設計爬坡實驗，即對顯著因素進行濃度的梯度設計，不顯著的因素取單因素EPS最佳濃度值。

1.3.4 中心組合設計實驗 用中心組合設計進行響應面優(yōu)化，通過實驗數(shù)據(jù)擬合響應面模型，得到二次多項式，并最終確定最佳發(fā)酵條件。二次多項式為描述響應量（應變量）和自變量關(guān)系的經(jīng)驗模型[7]。中心組合水平取值見表2。

表2 中心組合設計水平及其編碼Table.2 Range and levels of central composite design

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗做3個平行，Excel進行實驗數(shù)據(jù)誤差分析。Design Expert軟件對部分因子實驗，中心組合設計實驗進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 碳源實驗 由圖1可知，紅緣擬層孔菌產(chǎn)EPS最適碳源為蔗糖，蔗糖利用率較高可能是由于紅緣擬層孔菌具有較高的蔗糖酶活性。有文獻報道有些真菌以蔗糖為底物時，能分泌蔗糖酶催化底物蔗糖水解消耗[13]；另外，隨著蔗糖濃度的上升，其EPS產(chǎn)量先上升后下降，在蔗糖濃度為15%時，EPS達到最大值。這可能是由于過低的底物濃度不能最大限度地滿足紅緣擬層孔菌的生長需求。相反，底物濃度過高導致培養(yǎng)基黏度增加，進而影響菌體的生長和產(chǎn)物的分泌。

2.1.2 氮源實驗 由圖2可知，紅緣擬層孔菌產(chǎn)EPS最適氮源為酵母粉，這可能是由于酵母粉是有機氮源，其含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素，能夠促進多糖的合成[14]。酵母粉濃度在1%時，EPS產(chǎn)量達到最大值，為1.57g/L。繼續(xù)增加酵母粉濃度會抑制EPS的合成，這可能是由于酵母粉成分復雜，后期底物消耗不完，會誘導產(chǎn)生一些酶降解紅緣擬層孔菌菌絲體。

圖1 不同碳源及最佳碳源濃度對紅緣擬層孔菌EPS的影響Fig.1 Effect of different carbon source and sucrose concentration on the EPS production of Fomitopsis pinicola

圖2 不同氮源及最佳氮源對紅緣擬層孔菌產(chǎn)EPS的影響Fig.2 Effect of different nitrogen source and yeast extract concentration on the EPS production of Fomitopsis pinicola

2.1.3 無機離子實驗 由表3可知，對于相同添加量的無機鹽，MgSO4·7H2O、KH2PO4對EPS產(chǎn)量影響較大。對兩者濃度進行優(yōu)化，如圖3所示，其最適濃度分別為分別20g/L、2g/L。這可能是由于KH2PO4中的磷元素是合成菌體細胞膜磷脂雙分子層的主要成分，磷含量適度過低（0.2%）會阻礙磷脂的合成，導致細胞膜通透性增加從而有利于EPS的分泌，過高會抑制EPS的釋放；相反磷含量過低可能不能滿足其正常生長需求。鎂離子影響EPS產(chǎn)量的原因在于鎂離子是各種酶的激活劑。同酵母粉類似，MgSO4·7H2O濃度過高，后期營養(yǎng)過剩，可能會激活降解紅緣擬層孔菌菌絲體的酶類，反而不利于EPS的積累產(chǎn)生。

表3 不同無機鹽對紅緣擬層孔菌EPS產(chǎn)量的影響Table.3 Effect of different inorganic salts on the EPS production of Fomitopsis pinicola

2.2 部分因子設計實驗及其結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4是影響EPS產(chǎn)量的重要因素。首先，通過部分因子實驗從四個因素篩選影響EPS產(chǎn)量的顯著因子，表4為部分因子設計及其對應EPS產(chǎn)量值。由表5實驗回歸模型分析可以看出，影響EPS產(chǎn)量顯著因子為蔗糖（p＜0.05）、酵母粉（p＜0.1），MgSO4·7H2O（p＜0.05），3個因素影響大小順序為蔗糖＞MgSO4·7H2O＞酵母粉。運用Design Expert軟件，得出EPS產(chǎn)量的多元一次回歸模型為：Y=2.78+0.57X1-0.17X2-0.12X3+0.24X4。

2.3 最陡爬坡實驗

響應面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實情形，在其他區(qū)域擬合方程與被近似的函數(shù)方程毫無相似之處，幾乎無意義[15]。根據(jù)部分因子實驗回歸方程確定正負效應來增加蔗糖和MgSO4·7H2O濃度，同時降低酵母粉濃度，同時將KH2PO4的濃度固定為2g/L。由表6可知，從起點開始，EPS產(chǎn)量逐漸增加直至第4組，此后EPS產(chǎn)量逐漸降低。因此，將第4組的培養(yǎng)基組合（蔗糖180g/L，酵母粉7g/L，MgSO4·7H2O 26g/L，KH2PO42g/L）作為下面中心組合實驗的中心點。

表4 部分因子設計結(jié)果Table.4 The result of fraction factor design

表5 部分因子設計多元回歸模型系數(shù)評估及其顯著性檢驗Table.5 Regression coeffecients estimation and their significance test for the quadratic polynomial model of fraction factor design

表6 最陡爬坡實驗設計及其結(jié)果Table.6 Experiment design and results of thesteepest ascent path

表7 中心組合實驗結(jié)果Table.7 The result of central composite design

表8 中心組合設計多元回歸模型系數(shù)評估及其顯著性Table.8 Regression coeffecients estimation and their significance test for the quadratic polynomial model of central composite design

2.3 中心組合設計實驗及其結(jié)果

結(jié)合部分因子設計和最陡爬坡實驗結(jié)果，進一步使用中心組合對影響EPS產(chǎn)量顯著因子（蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O）濃度進行3因素5水平響應面優(yōu)化。各因素編碼、水平及結(jié)果見表7。由表8、表9方差分析可知，以EPS產(chǎn)量為目標函數(shù)的回歸方程的回歸效果顯著（p＜0.0001），回歸方程為Y=4.02+0.12X1-0.046X2+0.040X4+0.015X1X2+5E-03X1X4+5E-03X2X4-回歸模型方差分析結(jié)果見表9，模型p＜0.0001，說明模型在α=0.01水平上極顯著。該模型的復相關(guān)系數(shù)R2=0.9520，失擬項不顯著p=0.1373＞0.05，說明該模型相關(guān)性良好。校正決定系數(shù)R2=0.9088，說明90.88%的符合度，有很高的可信度。一次項顯著性X1＞X2＞X4；二次項中X12、X22、X42顯著性水平為極顯著，交互項都不顯著。

表9 中心組合設計的多元回歸模型方差分析Table.9 Analysis of variance for the quadratic polynomialmodel of central composite design

2.5 響應面分析結(jié)果

由回歸方程所作的響應面立體分析圖如圖4所示，響應面值存在最大值。固定其中兩因素時，酵母粉對響應值EPS產(chǎn)量呈拋物線關(guān)系，蔗糖、MgSO4·7H2O趨勢則呈不同程度上升后變?yōu)槠骄彙SM三維圖坡度表示響應值受各變量因素的影響大小。由圖4可知，蔗糖和酵母粉，MgSO4·7H2O和酵母粉三維圖坡度較蔗糖和MgSO4·7H2O陡峭，其結(jié)果說明另兩者因素取值固定時，單因素蔗糖、酵母粉對EPS產(chǎn)量的影響大于MgSO4·7H2O；響應值與3個實驗因素并非線性關(guān)系，只有特定條件下，EPS產(chǎn)量才能達到最大值。利用Design Expert軟件，進行分析計算，得到合成EPS的最佳培養(yǎng)基為：蔗糖濃度為186.24g/L、酵母粉濃度為6.91g/L、MgSO4·7H2O 26.71g/L。考慮實際操作，確定最佳培養(yǎng)基成分分別為蔗糖濃度為186g/L、酵母粉濃度為7g/L、MgSO4·7H2O 27g/L，此條件下EPS產(chǎn)量預測值為4.02g/L。為了檢測模型方程的適用性，在響應面最佳培養(yǎng)條件下進行三組平行重復驗證，測得EPS產(chǎn)量平均值為（3.92±0.18）g/L，基本和預測值相近，說明多元二次回歸模型可以準確預測EPS產(chǎn)量。

圖4 實驗因素兩兩交互作用響應曲面圖Fig.4 Response surface polts showing the effects between two experimental factors

3 結(jié)論

在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用部分因子設計、中心組合設計實驗對紅緣擬層孔菌產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件進行了響應面優(yōu)化，建立了EPS與顯著因子蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O 3個因素的二次多項式回歸模型，經(jīng)驗證實驗證明該模型合理可靠。最終確定紅緣擬層孔菌產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)基為：蔗糖186g/L、酵母粉7g/L，MgSO4·7H2O 27g/L，KH2PO42g/L。在此條件下，EPS產(chǎn)量高達4.02g/L，重復驗證測得EPS產(chǎn)量平均值為（3.92±0.18）g/L，兩者相對偏差小于5%。因此，采用響應面法優(yōu)化紅緣擬層孔菌培養(yǎng)基組成穩(wěn)定可行，可為后續(xù)紅緣擬層孔菌的液體規(guī)模培養(yǎng)及多糖產(chǎn)物的放大制備奠定基礎(chǔ)。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上海科學技術(shù)出版社，1999.

[2]戴玉成，圖力古爾.中國東北野生食藥用真菌圖志[M].北京：科學出版社，2007.

[3]陳先暉，閆浩，戈群妹，等.紅緣擬層孔菌醇提物弱極性成分分析及抗腫瘤、抗氧化活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011（1）：356-358.

[4]張麗萍，苗春艷，許麗艷.紅緣層孔菌多糖對小鼠核酸蛋白質(zhì)合成及對腫瘤S-180病毒CBV-3、HSV-I細胞增殖的影響[J].東北師大學報：自然科學版，1993（2）：104-108.

[5]馬玲.3種食用菌中多糖的提取與鑒定[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15（2）：174-175.

[6]馬琳，徐田田，張鐵軍.紅緣擬層孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方的研究.藥物評價研究[J].2010，33（2）：121-124.

[7]雷德柱，胡位榮.生物工程中游技術(shù)實驗手冊[M].北京：科學出版社，2010：43-45.

[8]Ambat P，Ayyanna C.Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface methods[J].Journal of Microbiology and Biotechnology，2001（17）：331-335.

[9]Ratnam BVV，Narasimha Rao M，Dmodar Rao M，et al. Optimization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch using response surface methodology[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2003（19）：523-526.

[10]Trupkin S，Levin S，F(xiàn)orchiassin F.Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2003（30）：682-690.

[11]劉志祥，曾超珍.響應面法在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應用[J].北方園藝，2009（2）：127-129.

[12]Hazarika S，Goswami P，Dutta N N，et al.Ethyl oleate synthesis by Porcine pancreatic lipase in organic solvent[J]. Chem Eng J，2002，85（1）：61-68.

[13]Park C P，Choi H J，Oh D K.Lactosucrose production by various microorganisms harboring levansucrase activity[J]. Biotechnology Letters，2005，27（7）：495-497.

[14]Pokhrel C P，Ohga S.Submerged culture conditions for mycelial yield and polysaccharides production by Lyophyllum decastes[J].Food Chemistry，2007，105：641-646.

[15]Davies OL，George EP，Lewis RC.The design and analysis of industrial experiments[M].London：Longman Group Limited，1978：45-48.

Optimization of culture medium of Fomitopsis pinicola for exopolysaccharide production by response surface methodology

SHENG Zhi-cun1，HAO Li-min1，2，*，JIA Shi-ru1，TAO Ru-yu1，ZHANG Hong3，LU Ji-ke2，4
（1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.The Quartermaster Equipment Institute of General Logistics Department of People’s Liberation Army，Beijing 100010，China；3.The Outpatient Department of Armed Police Forces of General Headquarters，Beijing 100089，China；4.School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

Response surface methodology was employed to optimize the culture medium for exopolysaccharide production from Fomitopsis pinicola.Exopolysaccharide yield was investigated with respect to the concentration of sucrose，yeast extract and MgSO4·7H2O based on these results of single factor experiment.A quadratic regression model was established on a three-variable，five-level center composite design.The optimum concentration of sucrose，yeast extract and MgSO4·7H2O were 186g/L，7g/L and 27g/L，resepectively.Under these conditions，the predicted value of EPS yield was 4.02g/L，while the actual value was（3.92±0.18）g/L.So response surface methodology was feasible for optimization of fermentation medium of Fomitopsis pinicola for EPS production.

Fomitopsis pinicola；Fomitopsis pinicola exopolysaccharide；response surface methodology

TS201.3

A

1002-0306（2014）02-0194-06

2013－12－09 *通訊聯(lián)系人

圣志存（1988-），男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程原理。