鎖擲酵母中圓酵母素穩定性的研究

施秋妤，汪何雅，錢 和

（江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

鎖擲酵母中圓酵母素穩定性的研究

施秋妤，汪何雅，錢 和*

（江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

研究了鎖擲酵母中圓酵母素的穩定性，以色素保留率和其全反式構型百分含量為指標，測定了其在光照、空氣及溫度條件下的變化。結果表明，隨著溫度升高，圓酵母素損失加劇，溫度在80～121℃范圍時，褪色加快，此時50%～90%的全反式構型向順式結構轉變；色素在光照條件下很不穩定，陽光直射時色素氧化降解迅速；充入空氣貯存7d后，90%的圓酵母素發生氧化降解，但其對圓酵母素保留率的影響大于對其反式構型含量的影響。進一步得出，光、溫度和空氣對圓酵母素的保留率和全反式構型的影響變化趨勢一致，光和溫度對色素全反式構型影響較大，圓酵母素的異構化主要受光和溫度影響。

鎖擲酵母，圓酵母素，幾何異構體，穩定性

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于植物、動物及微生物（藻類，細菌及酵母等）中的天然色素。它不僅可以淬滅自由基、清除單線態氧，作為合成維生素A的前體物質，還能增強人體免疫力，降低多種癌癥的發病率，因此常被應用于食品、化妝品、醫藥等領域[1]。采用酵母生產類胡蘿卜素具有營養要求簡單粗放、發酵周期短、生殖方式簡單等優點，適合工業化生產[2]。已有研究報道鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）富含β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、圓酵母素以及紅酵母紅素，但國內外關于圓酵母素的報道非常少[3]。

圓酵母素（torulene）是一種只有碳氫組成的類胡蘿卜素（圖1），具有13個共軛雙鍵，其共軛烯烴長鏈一端具有可以轉化為VA活性的β-芷香環，另一端具有與番茄紅素相似的結構特性，其功能活性值得深入研究；再者，目前圓酵母素已有成熟的菌株（Sporidiobolus pararoseus）可以進行發酵生產，適合工業化生產，應用前景較為可觀。而類胡蘿卜特有的共軛多聚烯結構使其穩定性相對較差，在光照、氧等條件下易氧化和異構化，從而導致褪色或吸收峰偏移等。本文通過光、氧和溫度對圓酵母素穩定性的影響，確定了其最佳貯藏條件，此研究對于確保提取、加工及貯藏過程中色素的穩定性及防止氧化損失具有重要參考價值[4-5]，奠定了其后續功能活性深入探究的理論基礎。

圖1 全反式圓酵母素的化學結構Fig.1 All-trans-torulene chemical structure

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus） 由本實驗室篩選獲得；甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、甲基叔丁基醚（MTBE） 均為色譜純，美國Tedia公司；正己烷、石油醚（30～60℃）、丙酮 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

HITACHI Chromaster高效液相色譜儀 日本，包括CM-5110四元泵，CM-5210自動進樣器，CM-5310柱溫箱和CM-5430二極管陣列檢測器。

1.2 實驗方法

1.2.1 圓酵母素的提取、分離和純化 類胡蘿卜素為鎖擲酵母的胞內色素，參考并改進前人的方法[1，6]，采用酸熱破壁法。將鎖擲酵母發酵液離心后收集得到的菌體置于2mol/L HCl中，沸水浴煮沸5min，迅速冰浴冷卻。將破壁的菌體置于分液漏斗中，棄去下層，所得上層液體中加入丙酮，搖勻，然后加正己烷萃取攪拌，收集上層粗色素混合液，并用蒸餾水洗去雜質，重復此步驟至細胞色淺或無色。粗提液減壓濃縮后-20℃充氮保存。

濃縮的粗提液進行硅膠柱層析分離，梯度洗脫。具體洗脫條件參照李曉芹等[3]的方法，純化并制備圓酵母素。整個純化過程均在弱光條件下進行。圓酵母素洗脫液減壓濃縮并加入0.1%BHT，-60℃充氮保存防止色素氧化降解。

1.2.2 圓酵母素的高效液相分析

1.2.2.1 C18-HPLC檢測分析純化的圓酵母素 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），流動相洗脫條件參照并優化Davoli等[7]的研究。流動相A為乙腈∶水∶甲酸（86∶10∶4，v/v/v），流動相B為乙酸乙酯∶甲酸（96∶4，v/v）；梯度洗脫：0～25min，A由100%降至0，25～30min，B由100%降至0；25～32min，A回復至100%；流速：1.0mL/min，檢測波長：450nm。

1.2.2.2 濃鹽酸化學定性[8]取2支試管，各加入圓酵母素的石油醚溶液10mL，另各加入9mL甲醇，然后在第一管加入1mL濃鹽酸，第二管加入1mL水，搖勻后觀察1h，觀察顏色的變化。

1.2.2.3 C30-HPLC分離圓酵母素幾何異構體 色譜柱：YMC C30（4.6×250mm，5μm），通過反復實驗改進建立的優化洗脫方法。流動相A為甲醇∶甲基叔丁基醚∶水（50∶47.5∶2.5，v/v/v），流動相B為甲醇∶甲基叔丁基醚∶水（8∶90∶2，v/v/v）；梯度洗脫：0～25min，保持A為100%，B為0，10min內A降至85%，20min內B由15%線性升至55%并保持到運行結束；檢測波長：485nm，DAD光譜收集范圍：200～600nm。

1.2.3 圓酵母素保留率和其全反式構型（all-trans）百分含量的測定 圓酵母素保留率采用HPLC測定。洗脫條件同上述1.2.2.1。圓酵母素保留率為實驗條件下樣品的圓酵母素含量和實驗開始時含量的比值，即為HPLC所測得的實驗條件下和初始條件的圓酵母素峰面積之比；全反式構型占純化所得圓酵母素所有幾何異構體的百分含量亦采用高效液相色譜法測定。洗脫條件如上述1.2.2.3，亦用峰面積之比表示。

1.2.4 溫度對圓酵母素穩定性的影響 食品加工中常用的熱處理方式有巴氏殺菌、阿氏殺菌等，因此選擇以下5個溫度作為考察對象。取10mL DMSO色素溶液分別置于40、60、80℃條件下水浴，恒溫箱中100℃和121℃恒溫加熱，每隔一段時間定時取樣，平行三次。

1.2.5 光對圓酵母素穩定性的影響 取10mL正己烷色素溶液于螺旋口玻璃瓶中，分別取室內日光燈照射、室外陽光直射、室內自然光、室內避光和4℃避光5個處理。每隔一段時間取樣，平行三次。

1.2.6 空氣對圓酵母素穩定性的影響 取10mL正己烷色素溶液分別取室溫25℃敞口、密封及充氮保存3個處理，每天將敞口的圓酵母素溶液補足溶劑并定時取樣。平行三次。

2 結果與分析

2.1 HPLC（C18）檢測純化圓酵母素

李曉芹等[3]已鑒定鎖擲酵母中富含β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、圓酵母素以及紅酵母紅素四種主要色素。本實驗經過硅膠柱層析分離純化及高效液相色譜分析所得圓酵母素的C18-HPLC色譜圖及對應紫外光譜掃描圖如圖2所示，（A）中1號液相峰對應了（B）中類胡蘿卜素特有的“三指形”吸收峰（圖2（B）），一個主峰及兩個肩峰的吸收分別在484、460、516nm（石油醚），這與文獻報道的圓酵母素在石油醚中的最大吸收峰485、460、518nm基本一致[9]，進一步鑒定柱層析分離純化所得為圓酵母素。Iriani等[10]報道圓酵母素順式吸收主要在380nm左右，與圖2（B）中近紫外區域出現的380nm處的特征順式峰一致，為圓酵母素幾何異構體的分離提供了理論依據。1號主液相峰旁邊幾乎被基線掩蓋的小峰根據DAD光譜數據（與1號主峰的最大吸收峰相比，藍移5～10nm左右）被認為是圓酵母素的順式異構體。

2.2 濃鹽酸化學定性

圖2 色譜圖Fig.2 Chromatogram

取2支試管，各加入圓酵母素的石油醚溶液10mL，另各加入9mL甲醇，然后在第一管加入1mL濃鹽酸，第二管加入1mL水，搖勻后觀察1h，無顏色的變化。表明分子結構中沒有環氧結構。推斷得出，圓酵母素在純化過程中未產生環氧化物，便于圓酵母素幾何異構體的分析。

2.3 HPLC（C30）-DAD分離鑒定圓酵母素幾何異構體

由于C30與C18固定相相比具有更長的烷基鏈，大致與類胡蘿卜素分子長度相當，導致固定相的疏水性增強，從而延長類胡蘿卜素的保留時間，提高柱效，有利于其順、反式幾何異構體的良好分離[11]。圖3中共分離得到8種圓酵母幾何異構體，與全反式異構體相比，類胡蘿卜素順式異構體的主要電子吸收光譜特征表示：a.最大吸光值所在波長（λmax）略有紫移（2～20nm，視溶劑而異）；b.“順式吸收峰”（cis-peak）有明顯加強，且異構位置越靠近中心，此峰越高[12-13]。由于至今未有文獻報道有關圓酵母素順式異構體的光譜數據，我們無法確定發生順式轉變的雙鍵的具體位置。我們初步判定1～7號峰為圓酵母素的順式異構體，而8號峰未出現順式峰（表1），且其三指形吸收峰與文獻報道全反式-圓酵母素數值相近，因此判斷其為全反式-圓酵母素[10]。2.4 外界環境處理對圓酵母素穩定性的影響

圖3 鎖擲酵母中圓酵母素順反異構體分離的C30-HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of cis/trans isomers of torulene separated on with a YMC C30column from Sporidiobolus pararoseus

表1 圓酵母素幾何異構體的保留時間、光譜數據及百分含量（與圖2對應）Table.1 Retention time and UV-visible spectral characteristics of torulene geometrical isomers corresponding to Figure 2

不同光、氧和溫度條件處理會不同程度地引起圓酵母素氧化降解以及異構化反應，共同反映了圓酵母素對外界環境處理的穩定性。因此，本文分別以圓酵母素保留率和其反式構型百分含量作為表征指標，全面地研究圓酵母素的穩定性。

圖4 溫度對圓酵母素保留率和其全反式構型比例的影響Fig.4 Effect of temperature on the retention rate of torulene and percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers

2.4.1 溫度對圓酵母素保留率和其全反式構型的影響 圖4（A，B）為溫度對圓酵母素保留率的影響，隨著溫度的升高，圓酵母素的DMSO（沸點189℃）溶液的保留率逐漸下降。40～60℃處理對色素的破壞較小，色素保留率分別從100%降至89%和80%，但溫度升至80℃時，色素迅速氧化降解，4h處理后保留率小于30%，100、121℃處理時，95%左右圓酵母素都已經損失；全反式結構是類胡蘿卜素幾何異構體中最穩定的構型，其百分含量的高低間接反映了其穩定性變化。圖4（C，D）為溫度對圓酵母素中全反式構型百分含量的影響，其變化趨勢基本與色素保留率變化一致，40、60、80℃分別處理4h后，其全反式構型百分含量從63%左右降至59%、51%和27%，100、121℃處理100min后，圓酵母素全反式構型百分含量則降至15%和5%。

2.4.2 光對圓酵母素保留率和其全反式構型的影響

圖5為光對圓酵母素保留率的影響，色素對陽光和日光燈光較為敏感，尤以陽光更為顯著，經陽光直射3h后圓酵母素保留率為23%，這可能是由于紫外光和溫度的雙重效應引起的；其次，色素對日光燈光也不太穩定，相比而言，室內自然光則較為柔和，因此色素損失相對要緩慢的多。色素對光的這種敏感性是由于類胡蘿卜素分子內部不飽和雙鍵等特殊結構在光作用下自身的氧化分解，從而導致雙鍵消失，使得吸收光譜發生變化，吸收波長不再出現于可見區域，其感官變化就是色素褪色[5，14]。當處于同等避光條件下，25℃與4℃不同的處理對圓酵母素保留率影響較小，無顯著差異，儲藏14d后色素保留率均在85%左右，色素在低溫（4℃）下更為穩定；表2、表3反映了陽光直射處理180min后，全反式-圓酵母素從原先的62%降至17%，整個體系處于非常不穩定的狀態。日光燈光照射3h后，全反式構型降至41.90%，順式結構在圓酵母素幾何構型中占主體，說明圓酵母素對日光燈光很不穩定。自然光對圓酵母素全反式構型影響較小，儲存14d后全反式構型百分含量從64%降至51%左右，25℃避光與4℃避光相比，全反式構型百分含量略有提高，說明低溫冷藏可增強圓酵母素穩定性。可見圓酵母素在光照條件下極其不穩定，因此在提取及加工過程中應盡量避光。

圖5 光對圓酵母素保留率的影響Fig.5 Effect of light on the retention rate of torulene

表2 日光燈光和陽光照射對圓酵母素全反式構型百分含量的影響（%）Table.2 Effect of fluorescent lamp and sunshine on the percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers（%）

表3 室內自然光對圓酵母素全反式構型百分含量的影響（%）Table.3 Effect of room light on the percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers（%）

2.4.3 空氣對圓酵母素保留率和其全反式構型的影響 空氣對圓酵母素保留率的影響大于對其反式構型含量的影響（圖6和表4），可能由于氧氣引起圓酵母素的氧化降解反應大于其異構化效應。充入空氣7d后，90%的圓酵母素發生氧化降解，但其全反式構型百分含量維持在54%左右；充入氮氣后，貯藏7d后圓酵母素保留率與對照組相比從71%增至81%，由于氮氣隔絕了氧氣，因此在一定程度上起到了良好的保護作用，但其對圓酵母素全反式構型百分含量并無明顯保護作用，變化趨勢基本與對照組一致。

圖6 空氣對圓酵母素保留率的影響Fig.6 Effect of air on the retention rate of torulene

表4 空氣對圓酵母素全反式構型百分含量的影響（%）Table.4 Effect of air on the percent of all-trans-torulene among torulene geometrical isomers（%）

3 結論

3.1利用YMC C30柱和梯度洗脫，建立HPLC-DAD分離檢測鎖擲酵母中圓酵母素同分異構體的方法，共分離得到7種順式和1種全反式異構體，且全反式構型占64%左右。

3.2光、溫度和空氣對圓酵母素的保留率和全反式構型的影響趨勢一致，光和溫度對色素全反式構型影響較大，進一步驗證了類胡蘿卜素的異構化主要受光和溫度影響，與文獻報道一致[15]。

3.3圓酵母素對60℃以下的溫度較為穩定，但對80℃及以上的溫度非常不穩定，此時50%～90%的全反式構型消失，逐漸向順式結構轉變；色素對光也很敏感，圓酵母素保留率和全反式構型的穩定性為：陽光＜日光燈光＜室內自然光＜避光；圓酵母素敞口（充入空氣）貯藏14d，幾乎完全失去顏色，充入氮氣能減緩圓酵母素的氧化降解。綜上所述，圓酵母素應在低溫、避光、充氮或加入適量抗氧化劑（如BHT）的環境下保存。

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Study on the stability of torulene from Sporidiobolus pararoseus

SHI Qiu-yu，WANG He-ya，QIAN He*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The torulene stability from Sporidiobolus pararoseus was studied in this paper.The retention rate of total torulene and percent of all-trans torulene among torulene geometrical isomers were determined under different conditions，such as light，oxygen and temperature.The results showed that torulene had a great loss with the increasing temperature and faded intensified when the temperature reached 80～121℃ and about percent of 50 to 70 of total all-trans torulene configuration gradually transformed to cis-torulene isomers at that time；Torulene was quite unstable under light and degraded rapidly especially in direct sunlight；Percent of 90 torulene experienced oxidation and degradation after storage for a week filled with air which had an insignificant effect on the percentage of all-trans configuration of torulene.We have further concluded that light，oxygen and temperature had the same trend on the effect of total torulene retention rate and all-trans torulene relative percentage，and torulene isomerization was mainly affected by light and temperature.

Sporidiobolus pararoseus；torulene；geometrical isomers；stability

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0135-05

2013－07－05 *通訊聯系人

施秋妤（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然色素的研究。

國家科技支撐項目（2012BAD36B02）。