柱前在線衍生-高效液相色譜法測定保健食品納豆膠囊中的牛磺酸

王宏華，劉菲，孫浩思

（北京燕京啤酒集團公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京101300）

柱前在線衍生-高效液相色譜法測定保健食品納豆膠囊中的牛磺酸

王宏華，劉菲，孫浩思

（北京燕京啤酒集團公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京101300）

建立了檢測保健食品中牛磺酸的柱前在線衍生-高效液相色譜方法。樣品經過去離子水提取，與鄰苯二甲醛在線衍生，以A相：0.02 mmol/L的乙酸鈉（pH 7.2，0.018%三乙胺，0.3%的四氫呋喃）；B相：100 mmol/L的乙酸鈉（pH 7.2）20%，乙腈40%，甲醇40%為流動相，梯度洗脫，采用Thermo Hypersil ODS C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離，紫外線檢測。方法檢出限為0.51 mg/L；標準曲線的線性范圍為0～1 000.0 mg/L，相關系數R2=0.999 2，具有良好的線性關系，加標回收率為103.9%～105.0%，相對標準偏差為0.9%～2.9%。該方法的靈敏度高、準確性好、前處理操作簡單，適用于保健食品納豆膠囊中牛磺酸含量的檢測。

鄰苯二甲醛；柱前在線衍生；高效液相色譜；牛磺酸；保健食品；納豆膠囊

牛磺酸又稱2-氨基乙磺酸，因1827年首次從牛膽汁分離出來而得名，長期以來對其的認知只停留在無功能的代謝產物。直到1975年HAYES K C等[1]發現因缺乏牛磺酸可使貓的視網膜老化甚至失明，牛磺酸的營養生理功能才得到國內外學者的重視并得以研究，此過程也逐步深入認識了其生物營養學價值。目前，美國、日本等發達國家有99%的牛磺酸用于食品添加劑，它們規定在嬰幼兒食品中必須添加一定量的牛磺酸[2]。我國在這方面起步較晚，在1993年批準牛磺酸在乳制品、嬰幼兒食品和谷物制品、強化飲料中使用。諸多研究表明，牛磺酸具有廣泛的生理功能，是調節機體正常生理活動的重要活性物質，在實際生產和日常生活中具有廣泛的應用價值[3]。

牛磺酸分子式為C2H6N2O3S，分子質量為125.15[4]。純品為無色或白色斜狀晶體，無臭，化學性質穩定，溶于乙醚等有機溶劑，是一種含硫的非蛋白氨基酸，在體內以游離狀態存在，不參與體內蛋白的生物合成[5]。牛磺酸雖不參與體內蛋白質合成，但卻與胱氨酸、半胱氨酸的代謝密切相關[6]，具有保護心血管系統、促進脂肪乳化、改善視功能和抗氧化等生理功能。人體主要通過攝取食物中的牛磺酸滿足機體需要。牛磺酸幾乎存在于所有生物之中，哺乳動物的主要臟器（如心、腦、肝臟）中含量較高，海產品中含量頗為豐富[7]。

目前測定食品中牛磺酸的方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）熒光法[8]、薄層色譜法[9]、氣相色譜法[10-11]、高效液相色譜法[12-14]、氨基酸自動分析法[7]、酸堿滴定法[4]等。酸堿滴定法簡便易行，原理簡單，但靈敏度及準確度均較低，且測定過程中干擾較多，個樣的差別較大，無法滿足牛磺酸含量較低的樣品的測定。薄層色譜法靈敏度較低、屬于半定量的方法，而且薄層厚度、薄層板的制備、點樣技術以及展開的條件等難以保持恒定，從而影響定量的準確性。氣相色譜法對樣品的衍生化等方面要求較高。氨基酸自動分析法在分析的種類和數量等方面受到限制。由于高效液相色譜法較高的靈敏度、可靠性及相對較短的分析時間，使其成為測定牛磺酸最常使用的方法[15]。任一平等[12]應用鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生法測定食品中的牛磺酸，樣品經預處理后，按比例加入定量的OPA衍生反應試劑，在堿性條件下與樣液中的牛磺酸生成具有強熒光的物質，在開始衍生反應1 min后，立即終止反應，進樣測定。孫潔[13]研究比較了氨基酸分析（amino acid analyzer，AAA）法與HPLC法，AAA法主要是樣品經前處理，用去蛋白之后的樣液經離子交換柱層析分離，被分離出的氨基酸通過柱后衍生與茚三酮溶液反應顯色，用紫外檢測器檢測。丹磺酰氯柱前衍生HPLC測定牛磺酸，試樣經水溶解提取，沉淀蛋白后取上清液用丹磺酰氯衍生化反應，室溫避光衍生反應2 h，加入鹽酸甲胺溶液終止反應，上清液進樣測定。這兩種方法的前處理過于復雜，不容易操作。本研究借鑒萬玉萍等[14]的方法中的樣品前處理，對測定條件進行了優化，樣品應用OPA柱前在線衍生測定保健食品納豆膠囊中的牛磺酸，方法簡捷可靠，結果重復性良好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕京中發牌改善記憶膠囊：北京燕京中發生物技術有限公司。

鄰苯二甲醛（10 mg/mL）、硼酸緩沖液（0.4 mol/L，pH 10.2）：美國安捷倫公司；冰醋酸（純度99.5%）、甲醇、乙腈（色譜級）、無水乙酸鈉（分析純）、三乙胺、四氫呋喃（色譜級）、牛磺酸（純度≥99%）：美國Sigma公司；所有用水都采用Milli Q純水。

1.2 儀器與設備

1100高效液相色譜儀（真空脫氣器、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、UV檢測器）：美國安捷倫公司；B1210E-DTH超聲水浴：美國賽默飛世爾公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：BDS HYPERSIL C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相：0.02 mmol/L乙酸鈉加0.018%三乙胺混勻，用10%冰乙酸調pH值至7.2，加0.3%的四氫呋喃混勻，過0.45 μm濾膜過濾備用；B相：20%100 mmol/L乙酸鈉，用10%冰乙酸調pH值至7.2，體積分數為40%乙腈、40%甲醇過0.45 μm濾膜過濾備用；程序洗脫梯度如表1所示；流速：1 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：1 μL；檢測波長：338 nm。

表1 樣品梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of samples

1.3.2 標樣溶液配制

稱取牛磺酸標樣100.0 mg于50 mL容量瓶中，用去離子水溶解定容，配制成質量濃度為2 000.0 mg/L的貯備液，于4℃冷藏備用。工作標準溶液用去離子水把貯備液稀釋成100.0 mg/L。

1.3.3 樣品處理

稱取樣品（納豆膠囊內部粉末）200.0 mg于100 mL容量瓶中，加入適量去離子水溶解樣品，放置于143 W超聲波水浴中室溫提取10 min，用去離子水定容，折疊濾紙過濾，濾液用0.45 μm濾膜過濾后備用。

2 結果與分析

2.1 流動相與波長的選擇

分別比較了使用10 mmol/L的乙酸鈉緩沖液-乙腈= 70∶30及甲醇-乙腈-乙酸鈉梯度洗脫，試驗發現后者的分離效果更好。另比較不同的檢測器波長（330 nm和338 nm），發現前者雜峰的響應要高于后者，因此選用338 nm為試驗用波長。

2.2 衍生試劑用量的試驗

本研究的納豆膠囊[16]用于增強免疫力、改善記憶力，牛磺酸作為食品營養強化劑添加到納豆膠囊中，一般添加量為10 g/100 g左右，而OPA衍生試劑的用量需通過試驗確定。在任一平等[12]的研究中，20 μL樣品加20 μL OPA衍生試劑，萬玉萍等[14]的研究中以2.5 μL樣品加2.5 μL OPA衍生試劑，樣品與衍生試劑都是1∶1關系。考慮到原有檢測啤酒中氨基酸方法是以1.0μL樣品加1.0μLOPA衍生試劑，以防衍生不徹底，取三份1.0μL牛磺酸標樣（1 000.0 mg/L），分別加入1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL OPA衍生試劑作樣品制備和分析，結果見表2。

表2 OPA衍生劑用量試驗Table 2 OPA derivative dosage test

由表2可見，隨著衍生試劑用量的增加，測得的色譜峰面積逐漸變小，可能是由于總體積增加而使得色譜峰面積值減少，但換算成相同總體積時，面積依然減少，說明衍生試劑用量在2.0 μL、4.0 μL時沒有更多的衍生化牛磺酸產生，可確定衍生試劑1.0 μL時衍生完全。

2.3 衍生時間的試驗

在所有查找的資料中，衍生反應時間各不相同，有反應1 min[12]、2 min[13]后進樣。就此展開試驗，在其他條件不改變的情況下，進樣器程序中選擇混合振蕩后直接進樣，和混合振蕩后等待1 min、2 min進樣，試驗結果沒有區別。因此，選擇混合振蕩后直接進樣。

2.4 方法線性關系及檢出限

將標準貯備液適當稀釋，按上述色譜條件進樣分析。以牛磺酸的響應峰面積（Y）對其質量濃度（X，mg/L）作標準曲線，結果見圖1。

圖1 牛磺酸標準曲線Fig.1 Standard curve of taurine

由圖1可知，其線性范圍為0～1 000.0 mg/L，線性方程為Y=2.189 2X+2.760 3，相關系數R2=0.999 2，牛磺酸的質量濃度與其峰面積具有較好的線性關系，并以3倍信噪比，得出方法檢出限為0.51 mg/L。

2.5 方法精密度試驗

取3種不同添加量膠囊樣品，按照方法要求，分別測定其牛磺酸含量，在重復條件下獲得的6次獨立測定結果及均值和相對標準差，結果如表3所示。

表3 精密度試驗測定結果Table 3 Results of precision experiment

由表3可知，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.9%～2.9%，＜5%，表明該方法有很好的精密度。

2.6 加標回收率試驗

取一已知本底質量濃度的納豆膠囊，分別添加50.0 mg/g、100.0 mg/g的牛磺酸，去離子水為提取劑，重復測定3次，結果見表4。牛磺酸標樣、樣品及樣品加標的譜圖見圖2。

表4 回收率測定結果(n=3)Table 4 Determination results of recovery rate(n=3)

圖2 牛磺酸標樣、樣品及樣品加標的圖譜Fig.2 Chromatogram of tanrine standard sample,sample and adding standard sample

由表4可知，平均加標回收率為103.9%～105.0%，表明方法準確度較好。

2.7 樣品的檢測與分析

分別對不同批次的成品膠囊進行牛磺酸含量測定，測定結果如表5所示。

表5 納豆膠囊中牛磺酸含量Table 5 Taurine content in natto capsule

由表5可知，每粒膠囊0.4 g，含牛磺酸45 mg左右，每天2次，每次3粒，可以作為食品營養強化劑[17]使用，給人體提供270 mg相當含量的牛磺酸。

3 結論

采用HPLC柱前在線衍生方法可以準確測定保健食品納豆膠囊中的牛磺酸，該法的相對標準偏差為0.9%～2.9%，回收率為103.9%～105.0%。另由于牛磺酸多為游離態存在，易于與其他作用于蛋白質合成的氨基酸相區別，因而本方法靈敏度高，專一性強，最低檢出限為0.51 mg/L。可作為質量監督控制的有效方法，為其穩定高效的生產提供技術保障。

[1]HAYES K C,PRONCZUK A,ADDESA A E,et al.Taurine modulates platelet aggregation in cats and human[J].Am J Glin Nutr,1989,49(6): 1211-1232.

[2]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.169—2003食品中牛磺酸的測定[S].北京：中國標準出版社，2003.

[3]楊占軍.人體內一種不容忽視的一種氨基酸——牛磺酸[J].生物學雜志，2000，17（1）：33-34.

[4]中華人民共和國衛生部.GB 14759—2010食品添加劑牛磺酸[S].北京：中國標準出版社，2010.

[5]張平偉，楊祖英.牛磺酸的生理功能及其營養作用[J].中國食品衛生雜志，1997，9（5）：36-40.

[6]張剛，黃玉山.牛磺酸與運動能力[J].四川體育科學，2003（1）：11-12.

[7]王洪健，周興起，馮志強，等.氨基酸自動分析儀測定食品中牛磺酸的方法建立[J].現代食品科技，2012，28（3）：348-350.

[8]劉國斌，李見春.人血清中牛磺酸的HPLC-熒光法測定方法學研究[J].中國醫藥導報，2009（2）：42-44.

[9]楊祖英，張平偉.薄層色譜法測定食品中牛磺酸[J].衛生研究，1996，25（4）：248-250.

[10]丁永勝，牟世芬.氨基酸的分析方法及其應用進展[J].色譜，2004，22（3）：210-215.

[11]張莉，肖玉霞.廣東國賓茶中的氨基酸分析研究[J].茶葉，1995，21（2）：20-21.

[12]任一平，黃百芬，胡紅偉.應用OPA柱前衍生法測定食品中的牛磺酸[J].食品與發酵工業，1995（1）：430-448.

[13]孫潔.氨基酸分析儀和HPLC測定食品中牛磺酸的研究比較[J].食品工業，2012，33（8）：123-125.

[14]萬玉萍，段志敏，林佶，等.HPLC柱前衍生測定保健食品中牛磺酸含量[J].中國衛生檢驗雜志，2006，16（10）：1201-1202.

[15]方宏兵，王德強.食品中牛磺酸的檢測方法的研究進展[J].糧油食品，2011，19（4）：45-47.

[16]陳麗娟，沙長青.國外納豆激酶的開發現狀[J].生物技術，2003，13（6）：44-45.

[17]中華人民共和國衛生部.GB 14880—2012食品營養強化劑使用標準[S].北京：中國標準出版社，2012.

Determination of taurine in health food natto capsules by HPLC with precolumn derivatization

WANG Honghua,LIU Fei,SUN Haosi
(Beijing Key Laboratory of Beer Brewing Technology,Technical Center of Beijing Yanjing Beer Group Corporation, Beijing 101300,China)

The determination method of taurine in health food was established by HPLC with precolumn derivatization.Samples were extracted with deionized water,online derived with o-phthalaldehyde derivation,using phase A:0.02 mmol/L sodium acetate(pH 7.2,0.018% triethylamine,0.3% tetrahydrofuran);phase B:100 mmol/L sodium acetate(pH 7.2)20%,acetonitrile 40%,methanol 40%as mobile phase to conduct gradient elution. Samples were separated by Thermo Hypersil ODS C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)and detected by ultraviolet light.The detection limit was 0.51 mg/L,the standard curves were linear in the range of 0-1 000.0 mg/L,the linear relation was good with correlation coefficient R2=0.999 2;the adding recovery rate was 103.9%-105%,and the relative standard deviation was 0.9%-2.9%.The method has the advantage of high sensitivity,good accuracy,easy to operate,and suitable for determination of taurine content in health food natto capsules.

O-phthalaldehyde;online precolumn derivatization;HPLC;taurine;health food;natto capsules

O657.7

A

0254-5071（2014）10-0136-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.033

2014-08-15

北京市燕京啤酒集團內部課題

王宏華（1973-），女，高級工程師，本科，研究方向為液相色譜技術在啤酒釀造過程中的應用。