動物組織中賽庚啶競爭酶聯(lián)免疫法的建立

萬宇平，羅曉琴，郝小妹，崔廷婷，黃寶兵，朱亮亮

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京102206；2.大同市農產品質量安全檢驗檢測中心，山西大同037004）

動物組織中賽庚啶競爭酶聯(lián)免疫法的建立

萬宇平1，羅曉琴1，郝小妹1，崔廷婷1，黃寶兵2，朱亮亮1

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京102206；2.大同市農產品質量安全檢驗檢測中心，山西大同037004）

建立快速檢測動物組織中賽庚啶的競爭酶聯(lián)免疫法。制備賽庚啶人工抗原作為包被原，使用辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，構建快速檢測動物組織中賽庚啶的競爭酶聯(lián)免疫法。結果表明，Logit/Log擬合標準曲線方程為Y=-2.051 8X-1.353 4，相關系數R為0.995 7，半數抑制濃度（IC50）為0.23 μg/L，動物組織樣本的檢測限為0.3 μg/kg，賽庚啶陽性樣本的加標回收率為85.1%～114.5%，樣本重復檢測結果的變異系數為5.2%～9.6%。建立的競爭酶聯(lián)免疫吸附方法具有較好的特異性、回收率和重復穩(wěn)定性，可用于動物組織中賽庚啶殘留的檢測。

動物組織；賽庚啶；競爭酶聯(lián)免疫

賽庚啶（cyproheptadine）是一種抗組胺藥，具有抗膽堿能和鎮(zhèn)靜作用，可用于治療各種過敏性疾病，也可用于改善患者食欲[1-3]。近幾年在國內某些飼料產品中發(fā)現添加[4]，可能是為了通過刺激食欲來提高動物生長速度以達到增加體質量的目的。但食用含有賽庚啶殘留的動物源性產品會對人體造成不利影響，對兒童的作用更為明顯，高濃度可直接引發(fā)昏迷、呼吸急促、全身無力等中毒癥狀，嚴重者則直接導致死亡[4-5]。因此，我國農業(yè)部第1519號公告將賽庚啶列入《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質》清單。目前已有關于飼料、尿樣及藥劑中賽庚啶檢測方法的報道，主要采用液相色譜-串聯(lián)質譜法[6-12]。但該方法不適合現場大批量樣本的快速檢測。因此，有必要建立動物源性食品及其相關產品中賽庚啶殘留的測定方法。本研究結合實際工作需要，建立了競爭酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）快速測定動物組織中的賽庚啶，該方法較為靈敏、操作步驟簡單，檢測時間短，非常適合中小企業(yè)、基層檢測機構現場大量樣本的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、豬肝等樣本：超市；賽庚啶標準品（純度≥99%）、去甲基賽庚啶（純度≥99%）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（優(yōu)級純）、N,N-二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）（純度≥99%）、碳化二亞胺（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC）（純度≥99%）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（純度≥99%）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）：美國Sigma公司；醛基活化的辣根過氧化物酶：美國Thermo公司；其余試劑為國產分析純；賽庚啶單克隆抗體雜交瘤細胞株為北京勤邦生物技術有限公司制備保存。

1.2 儀器與設備

MK3酶標儀：美國Thermo公司；DSY-Ⅲ氮吹儀：北京金科精華苑科技有限公司；SH-400A均質器：上海禾工科學儀器有限公司；AUY220精密電子天平：日本島津公司；THZ-103B振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司；LD-3離心機：江蘇同君儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 賽庚啶半抗原合成

稱取0.55 g去甲基賽庚啶和1 mL吡啶溶于10 mL DMSO中，制成A液；稱取0.39 g溴乙酸叔丁酯溶于5 mL DMSO后于40℃條件下緩慢滴入A液中，滴加完畢后繼續(xù)反應4 h，蒸除溶劑；簡單柱層析分離后，除去溶劑，加入20 mL DMSO和5 mL甲酸，室溫條件下反應20 h，蒸除溶劑，乙醇-水體系中重結晶得到羧基賽庚啶，即為目標半抗原。

1.3.2 賽庚啶全抗原合成

全抗原合成采用活潑酯法，將半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被抗原，具體操作過程：取20 mg賽庚啶半抗原溶于1 mL DMF中，取30 mg EDC和NHS用0.2 mL去離子水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫條件下攪拌反應24 h，得到B液；取50 mg OVA充分溶解于3.8 mL檸檬酸鹽緩沖液（citrate buffer，CB）（pH 9.6）中，將B液逐滴緩慢加入蛋白溶液中，并于室溫條件下攪拌反應24 h；將終反應液在4℃0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.4）中透析72 h，每隔8 h換液1次。最后將無色溶液封裝后于-20℃冰箱保存。

1.3.3 酶標抗體的制備

使用辣根過氧化物酶標記抗體，制備方法參考張世偉等[13]的研究。將0.3 mg純化的抗體溶解于0.1 mol/L pH 9.5的碳酸鹽緩沖液中。加入0.1 mL 10 mg/mL的活化醛基的辣根過氧化物酶溶液后4℃反應過夜。加入30 μL 0.2 mol/L的賴氨酸終止反應，透析純化后備用。

1.3.4 競爭ELISA方法的建立

每孔加100 μL包被抗原，37℃溫育2 h；傾去包被液，經磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌1次，每孔加入200 μL封閉液，37℃溫育2 h，倒掉封閉液；每孔加入50 μL系列濃度的賽庚啶標準溶液（或樣品溶液）和50 μL酶標單克隆抗體，25℃避光反應40 min；洗滌4～5次后加入底物液A液（過氧化脲）和B液（四甲基聯(lián)苯胺）各50 μL/孔，25℃顯色15 min，2 mol/L H2SO4溶液終止反應后，設定酶標儀于波長450 nm處測定每孔吸光度值（OD450nm值）。

1.3.5 標準曲線的繪制

采用競爭ELISA方法建立標準曲線，分別選擇賽庚啶標準品質量濃度0、0.05 μg/L、0.15 μg/L、0.45 μg/L、1.35 μg/L、4.05 μg/L，以質量濃度為0 μg/L時的OD值為B0值，相應賽庚啶濃度的OD值為B值，以評定模型Logit（B/B0）為縱坐標，以賽庚啶標準品質量濃度（μg/L）的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的質量濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中喹諾酮類藥物的實際質量濃度。

1.3.6 樣本前處理方法的建立

用均質器均質樣本；稱取（2.0±0.05）g均質后的樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中；加入0.3 mL 2 mol/L硫酸溶液和3.7 mL乙腈，用振蕩器振蕩5 min混勻，室溫條件下4 000 r/min離心5 min；移取2 mL上層有機相至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入0.2 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，輕輕振蕩20 s，再加入2 mL三氯甲烷和4 mL正己烷，用振蕩器振蕩5 min混勻，室溫條件下4 000 r/min離心5 min；移取2 mL上層有機相至10 mL干凈玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；加入1 mL復溶液，用渦旋儀渦動30 s，待檢。

1.3.7 ELISA方法的評價

敏感性：用半數抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）和檢測限來評價方法的靈敏度。測定20次標準曲線的IC50，統(tǒng)計其平均值和浮動范圍；測定20個空白樣本，求出其B/B0在標準曲線上對應的質量濃度的平均值（Xˉ）和標準差（S），方法檢測限（method detection limit，MDL）=Xˉ+3S。

準確性和重復性：用回收率和變異系數分別來評價ELISA方法的準確性和重復性。以三個不同質量濃度的賽庚啶標準品分別對空白豬肉、牛肉、豬肝樣本進行添加回收率實驗，計算回收率和變異系數（coefficient of variation，CV）。

式中：Cx為添加了一定賽庚啶濃度的樣本經過標準曲線分析得到的實際質量濃度，μg/kg；C0為空白樣本經過標準曲線分析得到的實際質量濃度，μg/kg；C為實際添加的賽庚啶質量濃度，μg/kg。

穩(wěn)定性：將ELISA方法涉及到的各種試劑制備足量保存于37℃環(huán)境中，每隔1 d取出適量，分別測定0 μg/kg標準品的OD450nm值、IC50及按上述方法進行添加回收實驗所得的回收率，直到方法的靈敏度和回收率開始下降為止，根據實驗結果判斷相關試劑的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的確定

圖1 賽庚啶的檢測標準曲線Fig.1 Standard curve for cyproheptadine detection

在0.05～4.05 μg/L質量濃度范圍內，Logit（B/B0）與賽庚啶質量濃度對數呈現良好的線性關系（見圖1），建立擬合回歸直線方程為Y=-2.051 8X-1.353 4，相關系數r為0.995 7，半數抑制濃度（IC50）為0.23 μg/L。

2.2 敏感性測定

統(tǒng)計20次標準曲線的IC50平均值為0.22 μg/kg，浮動范圍為0.20～0.25 μg/kg；20個空白樣本的B/B0在標準曲線上對應的質量濃度的平均值（）和標準差（S）見表1，綜合考慮幾種樣本的檢測限數據，本方法對動物組織樣本的檢測限確定為0.3 μg/kg。

表1 方法對動物組織的檢測限Table 1 Limit of detection for animal tissue

2.3 準確性和重復性測定

取空白豬肉、牛肉、豬肝樣本，按表2所述的賽庚啶質量濃度添加對其進行加標回收率實驗，每個質量濃度做5個平行，計算加標回收率和變異系數，結果見表2。

表2 方法的準確性和重復性測定Table 2 Accuracy and repeatability of ELISA method

由表2可知，以三個不同質量濃度的賽庚啶標準品對空白豬肉、牛肉、豬肝樣本進行添加，其加標回收率為85.1%～114.5%，樣本重復檢測結果的變異系數為5.2%～9.6%，＜10%，說明該ELISA方法測定動物組織中賽庚啶殘留具有良好的準確性和重復性，可用于動物組織中賽庚啶殘留測定。

2.4 穩(wěn)定性測定

經測定，涉及到的各種試劑能在37℃條件下穩(wěn)定保存9 d，第10天開始各項參數出現下降。根據生化試劑在37℃每穩(wěn)定1 d，可相當于4～10℃保存一個半月[14]，可知，若將這些試劑組裝成商品化試劑盒，可在4℃條件下至少穩(wěn)定保存12個月。

3 結論

本研究以實驗室自制的單克隆抗體為基礎，初步建立了動物組織中賽庚啶殘留檢測的競爭酶聯(lián)免疫法。該方法的IC50浮動范圍為0.20～0.25 μg/L，對組織樣本的檢測限為0.3 μg/kg；賽庚啶陽性樣本加標回收率為85.1%～114.5%，樣本重復檢測結果的變異系數為5.2%～9.6%，具有良好的準確性和重復性，可用于動物組織中賽庚啶殘留測定。賽庚啶競爭酶聯(lián)免疫方法的建立，為進一步開發(fā)免疫檢測試劑盒奠定了基礎[15]，并為食品和飼料中賽庚啶殘留的監(jiān)控提供了便捷、靈敏的檢測方法。

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Establishment of competitive enzyme linked immunosorbent assay for determination of cyproheptadine in animal tissue

WAN Yuping1,LUO Xiaoqin1,HAO Xiaomei1,CUI Tingting1,HUANG Baobing2,ZHU Liangliang1
(1.Beijing Kwinbon Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 102206,China; 2.Datong Examine and Inspection Centre for Agriculture Products Safety and Quality,Datong 037004,China)

A competitive enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)for fast detection of cyproheptadine residues in animal tissue was developed. The one step competitive ELISA method was established using cyproheptadine complete antigen as coating antigen and radish peroxidase labeled monoclonal antibody for reaction antibody.Results showed that the Logit/Log calibration curve was Y=-2.051 8X-1.353 4(correlation coefficient R= 0.995 7),the half inhibitory concentration(IC50)was 0.23 μg/L,and the limitation of detection for animal tissue was 0.3 μg/kg.The added standard recovery for cyporheptadine residues in animal tissue was in the range of 85.1%-114.5%,and the coefficient of variation was from 5.2%to 9.6%.The developed ELISA method could be applied to quantitative detection for cyproheptadine residues in animal tissue.

animal tissue;cyproheptadine;ELISA

R392-33

A

0254-5071（2014）10-0130-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.031

2014-07-16

快速檢測技術及電動汽車相關產品和材料檢測驗證技術研究與示范（2012BAK26B04）

萬宇平（1982-），男，獸醫(yī)師，碩士，研究方向為食品安全快速檢測技術。