酒曲中羧甲基纖維素酶活力測定影響因素分析

趙爽，紀鳳娣，趙章林，宋昊，鄭玉芝*，艾金忠，胡軍

（1.北京一輕研究院，北京101111；2.北京紅星股份有限公司，北京101400）

酒曲中羧甲基纖維素酶活力測定影響因素分析

趙爽1，紀鳳娣1，趙章林1，宋昊1，鄭玉芝1*，艾金忠2，胡軍2

（1.北京一輕研究院，北京101111；2.北京紅星股份有限公司，北京101400）

對還原糖法測定酒曲中羧甲基纖維素酶活力的影響因素進行了探討，建立了適合酒曲中羧甲基纖維素酶活的測定方法。研究了酒曲中酶的提取方法（緩沖液與酒曲提取比例、酒曲中酶的溶出方式）、酶解反應條件（酶促反應pH、反應溫度、酶液與底物添加量）及空白的選擇。結果表明，最優條件為酒曲經-20℃冷凍過夜處理，用15倍質量的緩沖液振蕩提取30 min，5 000 r/min離心5 min，上清為原始酶液。酶解反應條件為pH值4.8，樣品為0.50 mL酶液和2.00 mL底物，空白為0.50 mL酶液和2.00 mL緩沖液，同時50℃反應30 min后添加3.0 mL DNS試劑，沸水浴顯色10 min，冷卻后空白補加2.00 mL底物，樣品管補2.00 mL緩沖液，分別用水定容至25 mL，測定波長540 nm。

酒曲；羧甲基纖維素酶活力；提取；酶解條件；空白選擇

固態白酒酒糟為白酒釀造過程中的主要副產物，我國每年白酒丟糟產量都＞2 500萬t[1]。酒糟含有一定的蛋白質、脂肪以及粗纖維等，說明固態白酒酒糟具有利用價值。依照循環經濟及可持續發展思路，固態白酒酒糟的資源化利用具有現實意義。據統計，白酒丟糟的粗纖維含量為18%～24%，其中包括纖維素和木質素。纖維素分子結構特殊，難以被人類充分利用，造成巨大的資源浪費和嚴重的環境污染，如酒曲中的纖維素酶能將酒槽的纖維素水解為可發酵糖，將提高酒糟的再利用率，極有發展前景。

纖維素酶是一種多組分的復合酶，近年來在食品工業、飼料工業生產及環保等領域中都有較大的應用價值[2]。秦廣利等[3]應用纖維素酶對醬香型白酒資源化利用進行了研究，在殘糟中添加纖維素酶10 U/g，出酒率比原糟提高了2.61%。岳思君等[4]篩選了有良好分解效果的纖維素分解菌。但是不同來源的纖維素酶組成及各組分比例有較大差異，同時纖維素酶作用的底物也比較復雜，致使纖維素酶活力的測定方法很多，且方法復雜而不統一[5-10]。并且不同的測定條件，對酶活力的最終測定結果有一定影響。目前常用的測定方法有：羧甲基纖維素（還原糖法）酶活力測定方法、濾紙酶活力法和棉花糖化力法等。國內許多單位分別采用了以上各種方法并進行了種種修改，使測定的方法更加多樣化，造成不同產品、不同結果之間無法相互比較的局面。目前，尚未見測定酒曲中纖維素酶活力方法的研究。因酒曲實際是多種酶的復合制劑，包括糖化酶、淀粉酶、纖維素酶等，因此純的酶制劑的測定方法不適用于酒曲中纖維素酶的測定，羧甲基纖維素酶活力（car-boxymethylcellulose activity，CMCA）主要代表外切β-1，4葡聚糖苷酶和內切酶的活力總和，在研究和實際生產中應用比較普遍。因此，為了消除其他酶對測定結果的影響，選擇適宜的酶活力測定條件，提高酒曲中纖維素酶活力測定結果的準確性，本研究參考我國輕工行業標準QB 2583—2003《纖維素酶制劑》[11]所采用的測定條件，對羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulose，CMC）的提取（標準方法并沒有此部分）及活力測定中的幾個主要影響因素進行了深入研究，以期為酒曲纖維素酶活的測定摸索出適合的酶液提取及測定條件，達到在酒曲測定方法與活力表示上的統一，便于相互比較與交流。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-Dinitrosalicylic aeid，DNS）（化學純）、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；實驗樣品為某市售酒曲。

DNS試劑：稱取3,5-二硝基水楊酸（10±0.1）g，置于約600 mL水中，逐漸加入氫氧化鈉10 g，在50℃水浴中（磁力）攪拌溶解，再依次加入酒石酸鉀鈉200 g、苯酚2 g和無水亞硫酸鈉5 g，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1 000 mL，過濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7 d后使用。

pH 4.8乙酸緩沖溶液：稱取三水乙酸鈉8.16 g，溶于約750 mL水中，加入乙酸2.31 mL，用水定容至1 000 mL。調節溶液的pH至（4.8±0.05）備用。

底物為CMC-Na溶液：稱取3.333 g CMC-Na，緩緩加入乙酸緩沖液約400 mL并加熱至80～90℃，邊加熱邊磁力攪拌，直至CMC-Na全部溶解，冷卻后用相應的緩沖液稀釋至500 mL，用2 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調節溶液的pH為（4.8±0.05），貯存于冰箱中備用。

1.2 儀器與設備

UV-2802分光光度計：北京合眾日盛科技有限公司；PHS-3C pH計：北京博翔興旺科技有限公司；Omni-Ruptor 4000超聲波破壁儀：Omni International；HF-2000R冷凍離心機：上海利鑫堅離心機有限公司；HZS-H水浴振蕩器：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒北京英博瑞科技有限公司；BSA224S-CW分析天平、HZ85-2型磁力攪拌器：北京博翔興旺科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維素酶活力檢測方法

檢測方法參考我國輕工行業標準QB 2583—2003《纖維素酶制劑》。CMCA定義：1 g固體酶在（50±0.1）℃、指定pH條件下，1 h水解羧甲基纖維素鈉底物，產生出相當于1 mg葡萄糖的還原糖量，為1個酶活力單位，U/g。羧甲基纖維素酶活力公式：

式中：X1為羧甲基纖維素酶活力，U/g；A為吸光度值在標準曲線上查得的還原糖量，mg；1/0.5為換算成酶液1 mL；n為酶樣的稀釋倍數；2為時間換算系數。

標準曲線的繪制：與QB 2583—2003不同，分別配制質量濃度為0.40 mg/mL、0.80 mg/mL、1.20 mg/mL、1.60 mg/mL、2.00 mg/mL、3.00 mg/mL的葡萄糖溶液，對應的葡萄糖量為0.20 mg、0.40 mg、0.60 mg、0.80 mg、1.00 mg、1.50 mg，以葡萄糖量（x）為橫坐標，波長540 nm下測得的吸光度值（y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 測定條件優化

對空白樣的選擇、緩沖液與酒曲提取比例、酒曲中酶的溶出方式、酶促反應pH、反應溫度、酶液與底物添加量6個因素進行考察（單因素試驗的條件，是在其他條件固定的情況下進行的），以纖維素酶活力為考察指標，對酶活力進行單因素方差分析，比較各水平之間是否存在顯著性差異。

（1）空白樣的選擇

樣品管：樣品0.5 mL，2.00 mL底物，50℃水浴30 min，3 mL DNS試劑。

空白1：2.00 mL底物，50℃水浴30 min，煮沸時加0.50 mL酶液（終止空白），反應結束時加3 mL DNS試劑；

空白2：2.00 mL底物+0.50 mL滅活酶液，其中酶液在沸水中煮15 min滅活，50℃水浴30 min，反應結束時加3 mL DNS試劑；

空白3：2.00 mL底物+0.50 mL酶液+3 mL DNS試劑，50℃水浴30 min；

空白4：0.50 mL酶液+2.00 mL緩沖液，不加底物，50℃水浴30 min，反應結束時加3 mL DNS試劑；

空白5：0.50 mL酶液，50℃水浴30 min，加3 mL DNS試劑，煮沸顯色后補2.00 mL底物；

空白6：0.50 mL酶液+2.00 mL緩沖液，50℃水浴30 min，加3 mL DNS試劑，煮沸顯色冷卻后補2.00 mL底物；樣品管補2.00 mL緩沖液。

（2）緩沖液與酒曲質量比

考察緩沖液與酒曲的質量比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的提取效果。

（3）酒曲中酶的溶出方式

方式1：酒曲+緩沖液振蕩提取；

方式2：研磨過的酒曲+緩沖液振蕩提取；

方式3：液氮研磨過的酒曲+緩沖液振蕩提取；

方式4：-20℃冷凍過夜的酒曲+緩沖振蕩液提取；

方式5：酒曲+緩沖液混合后，-20℃冷凍過夜后振蕩提取；

方式6：超聲破壁提取。振蕩提取條件為30℃、150 r/min水浴振蕩30 min；超聲條件為強度40%，脈沖50%，15 min。

（4）酶促反應pH

考察pH值分別為4.2、4.5、4.8、5.1、5.4時，纖維素酶活的變化。

（5）酶促反應溫度

考察溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃時纖維素酶活的變化。

（6）酶液與底物添加量

對0.50 mL+2.00 mL，1.00 mL+2.00 mL，2.00 mL+2.00 mL這三種情況的酶活進行了測定，前者為酶液量，后者為底物量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以葡萄糖量(x)為橫坐標，波長540 nm條件下測得的吸光度值(y)為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖1。對標準曲線進行線性回歸，得到回歸方程：y=0.450 7x+0.002 1，相關系數R2為0.999 4，表明二者線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 空白樣的確定

圖2 不同空白對纖維素酶活力的影響Fig.2 Effect of different blank on CMCA

實驗結果表明，以空白1所測酶活最高，但此空白沒有考慮到酶液本身糖化酶、淀粉酶及還原糖的影響，所以使得測量結果偏高。以空白2所測酶活較低，由于酒曲酶液中含有淀粉，在滅活酶液的時候淀粉糊化，使酶液變得黏稠，比色管中有少量固體顆粒，影響吸光度值的測定。以空白3未檢測出酶活力值，分析原因是因為DNS試劑并不能很好的終止酶反應，使得空白管與樣品管同時在發生酶解反應。以空白4、5、6分別得出的酶活值比較接近，這樣進行空白處理，既可扣除本底的還原糖影響，又可扣除糖化酶、淀粉酶等的影響；由于酶液中有少量的淀粉，使得糖化酶、淀粉酶作用于淀粉產生少量還原糖，測定的酶活結果低于空白1，這樣得出的結果更合理。5號空白酶液未在緩沖液中進行反應，結果不如6號穩定，空白6對于測定酒曲中的纖維素酶活力設計的更科學，合理的消除了酶液本身的影響，并且空白管與樣品管的體系一致，所以后續實驗以6號空白處理方法進行測定。

2.3 緩沖液與酒曲提取比例的確定

圖3 不同緩沖液與酒曲質量比對纖維素酶活力的影響Fig.3 Effect of different buffer and starter ratio on CMCA

由結果分析可知，采用緩沖液與酒曲的質量比為5∶1和10∶1的提取液，纖維素酶活力分別是7.939和12.017，而采用15∶1與20∶1提取時，纖維素酶活力分別為18.092和18.531，無顯著差異（P＞0.05），說明15:1提取已將酶提取的較完全，因此，緩沖液與酒曲的質量比15∶1為宜。

2.4 酒曲中酶溶出方式的確定

圖4 不同酒曲中酶溶出方式對纖維素酶活力的影響Fig.4 Effect of different starter treatment on CMCA

由圖4可知，酒曲+緩沖液振蕩提取酶活最低；比較冷凍與研磨方式可知，無論先加或后加緩沖液將酒曲-20℃冷凍過夜，測定的酶活結果均比研磨的效果要好，同時節省時間，且酒曲先冷凍后加緩沖液提取操作方便易行；冷凍處理后振蕩與超聲破壁比較，振蕩效果略好，這可能是因為振蕩提取加大了溶液分子之間的碰撞，且振蕩溫度較高，更有利于纖維素酶的提取。這里超聲破壁的方式并沒有表現出優勢，分析原因可能由于酒曲本身體系復雜，并且超聲溫度較低不利于酶的提取，綜合能源、時間等因素考慮，后續實驗采取酒曲-20℃冷凍過夜后加緩沖液振蕩方式進行提取。

2.5 酶促反應pH的確定

圖5 不同pH對纖維素酶活力的影響Fig.5 Effect of diffierent pH on CMCA

在纖維素酶系中作用于底物的最適pH大多在4.0～5.5[12]之間，酶促反應pH較為集中，但又不統一，pH在4.6～6.2之間[13-16]。對纖維素酶測得結果進行顯著性方差分析，差異顯著（P＜0.01）；對結果進行比較分析發現，pH 4.8與pH 5.1纖維素酶活力差異不顯著（P＞0.05），說明酒曲中的纖維素酶在pH為4.8～5.1之間均可，本實驗選擇pH值為4.8，與標準方法一致。

2.6 酶促反應溫度的確定

圖6 不同溫度對纖維素酶活力的影響Fig.6 Effect of diffierent temperature on CMCA

大多數化學反應的速率都和溫度有關，酶促反應也是如此。在不同溫度條件下進行某種酶促反應，以測得的反應速率為橫坐標，溫度為縱坐標作圖，即可得到鐘罩型曲線[17]。目前，在用DNS法測定纖維素酶活力的方法中常用的酶促反應溫度為40～50℃[18，19]。

由圖6可見，纖維素酶活力呈現出先增加后降低的趨勢，整個反應近似于鐘罩型曲線。當酶解溫度為50℃時，酶活力最高。對纖維素酶測得結果進行顯著性方差分析，差異顯著（P＜0.01）；對酶解溫度進行兩兩比較發現，50℃與60℃時纖維素酶活力差異并不顯著（P＞0.05），說明酒曲中的纖維素酶比較耐高溫，選擇50℃為最適溫度。

2.7 酶液與底物添加量的確定

本實驗對1.3.2中的酶液與底物添加量三種水平的酶活進行了測定。第一個水平酶活為18.1 U/g，后兩種水平由于酶液加的量比較大，酶液中淀粉酶及糖化酶酶解和本身含有的還原糖導致空白管吸光度較大，均＞1，致使結果不準確且不穩定。所以本實驗采取酶液和底物對應的添加量為0.50 mL+2.00 mL。

3 結論

本實驗參考QB 2583—2003《纖維素酶制劑》中還原糖法測定羧甲基纖維素酶活力，對酒曲中的CMCA的影響因素進行了探討，結果表明，最優條件為酒曲經-20℃冷凍過夜處理，用15倍的緩沖液振蕩提取30 min，5 000 r/m離心5 min，上清為原始酶液。酶解反應條件為pH 4.8，樣品0.50 mL和2.00 mL底物，空白為0.50 mL酶液和2.00 mL緩沖液，同時50℃反應30 min后添加3.0 mL DNS試劑，沸水浴顯色10 min，冷卻后補加2.00 mL底物，樣品管補2.00 mL緩沖液，該檢測方法適合酒曲的羧甲基纖維素酶測定。

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Analysis of affecting factors on determination of carboxymethyl cellulose activity in starter

ZHAO Shuang1,JI Fengdi1,ZHAO Zhanglin1,SONG Hao1,ZHENG Yuzhi1*,AI Jinzhong2,HU Jun2
(1.Beijing Industrial Technology Research Institute,Beijing 101111,China;2.Beijing Red Star Co.,Ltd.,Beijing101400)

The influence factor of reducing sugar method on carboxyl methyl cellulose activity(CMCA)of starter was discussed and a testing method suitable for CMCA determination was established.The research focused on the effect of enzyme extraction method in starter(extraction ratio of buffer and starter,enzyme extraction methods of starter),enzymolysis reaction conditions(enzymatic reaction pH,reaction temperature,enzyme and substrate addition)and blank choice.Experimental results showed that the optimal determination conditions were overnight cooling at-20℃, extracted through oscillation by 15 times quality buffer for 30 min,centrifuged with 5 000 r/min for 5 min.The supernatant was the crude enzyme solution.The reaction conditions of enzyme hydrolysis were as follows:0.50 ml enzyme with 2.00 ml substrate as sample and 0.50 ml enzyme with 2.00 ml buffer solution as blank,reaction time 30 min,temperature 50℃and pH 4.8.Then 3.0 ml DNS reagent was added and water bathed for 10 min for chromogenic reaction.After cooling,the blank was supplemented with 2.00 ml substrate and the sample was supplemented with 2.00 ml buffer solution,and then water were added to the solution to 25 ml.Finally the absorbance was determined at 540 nm.

starter;carboxymethyl cellulose activity;extract;hydrolysis conditions;blank choice

TS207.3

A

0254-5071（2014）10-0118-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.028

2014-07-09

趙爽（1988-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：鄭玉芝（1965-），女，教授級高級工程師，博士，研究方向為食品加工與檢測。