葡萄皮中白藜蘆醇提取條件優(yōu)化

張喜峰，李靜雅，錢悅，李林平，張芬琴

（河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000）

葡萄皮中白藜蘆醇提取條件優(yōu)化

張喜峰，李靜雅，錢悅，李林平，張芬琴*

（河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000）

采用響應(yīng)面優(yōu)化雙水相體系萃取葡萄皮中的白藜蘆醇。選取(無水乙醇+丙酮)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)三個因素，利用Box-Behnken Design研究各因素交互作用對白藜蘆醇萃取率的影響。結(jié)果表明，優(yōu)化萃取工藝條件為(無水乙醇+丙酮)質(zhì)量分?jǐn)?shù)22.3%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)24.0%、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.6%，在此條件下，白藜蘆醇的萃取率可達(dá)89.16%。

雙水相體系；白藜蘆醇；響應(yīng)面

甘肅河西走廊地處北緯36～40°，具有種植葡萄尤其是釀造葡萄的最佳光、熱、水、土資源組合狀態(tài)。在葡萄酒加工過程中，每年產(chǎn)生約占葡萄加工量20%～30%的皮渣廢棄物，其中主要是葡萄皮、種子和果梗等[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄皮中的白藜蘆醇在葡萄鮮果各部分中的含量最高[2]，其具有治療心力衰竭、防癌和降低糖尿病發(fā)病率以及抗氧化等保健功能[3-5]。因此，開展葡萄皮渣綜合利用，不僅可以獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益，而且能夠有效減輕環(huán)保壓力，獲得巨大的社會效益。

目前，提取葡萄皮中白藜蘆醇的方法主要為有機(jī)溶劑提取法[6]、超臨界萃取法[7]、大孔樹脂法[8]。這些方法存在提取率低、溶劑用量大、生產(chǎn)周期長、操作繁瑣、不宜工業(yè)化生產(chǎn)或設(shè)備要求高、能耗高、成本高等缺點(diǎn)。小分子有機(jī)溶劑/鹽體系作為一種新型的雙水相體系，因原料豐富、價(jià)格低廉、溶劑黏度小、傳質(zhì)速度快、試劑易回收等優(yōu)點(diǎn)[9]引起了廣泛關(guān)注，已被用于黃酮等天然產(chǎn)物的分離[10-12]。在（無水乙醇+丙酮）體系中，通過加鹽形成二元雙水相體系，考察了（無水乙醇+丙酮）體積比、（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相萃取白藜蘆醇分配行為的影響，以期為雙水相萃取技術(shù)在葡萄皮渣中白藜蘆醇提取中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取甘肅濱河食品工業(yè)集團(tuán)葡萄酒下腳料，經(jīng)挑選、清洗、曬干，得到干凈的葡萄皮。

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、硫酸銨：天津百世化工有限公司；無水乙醇：安徽安特食品股份有限公司；丙酮、濃鹽酸：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PL-203電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；XOSM5O超聲波-微波反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；DKB-501數(shù)顯超級恒溫水浴鍋：揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司；DHG-9101.1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海光譜儀器有限公司；722型分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白藜蘆醇含量測定[13]

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)白藜蘆醇，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度分別為2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL棕色容量瓶中，在波長306 nm處測定其吸光度值，同時以試劑空白作為參比，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 白藜蘆醇粗提液的制備

準(zhǔn)確稱取5 g葡萄皮粉末，以1∶20（g/mL）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在超聲波反應(yīng)系統(tǒng)中超聲15 min，5 000 r/min離心10 min，上清液為含白藜蘆醇粗提液，測定粗提液中白藜蘆醇的含量。

1.3.3 雙水相萃取方法

配制乙醇丙酮混合液和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定的雙水相體系，向其中加入白藜蘆醇粗提液后，充分振蕩，使體系充分完全混合，靜置0.5 h后，取樣測定上下相中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，考察相比（R）分配系數(shù)（K）和萃取率（Y），計(jì)算公式如下：

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究（無水乙醇+丙酮）體積比、（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇分配系數(shù)及萃取率的影響。

1.3.5 Box-Benhnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)3因素3水平17個組合Box-Behnken Design試驗(yàn)，確定白藜蘆醇萃取的最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 無水乙醇+丙酮體積比對白藜蘆醇萃取的影響

在無水乙醇與丙酮體積比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（V/V）條件下，確定（無水乙醇+丙酮）混合液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%，加入10%白藜蘆醇粗提液組成雙水相，充分混勻后，靜置分層，測定上下相白藜蘆醇含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 無水乙醇與丙酮體積比對二元體系分相的影響Fig.1 Effects of ethanol and acetone volume ratio on two phases

由圖1可知，在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定的情況下，隨著（無水乙醇+丙酮）體積比逐漸變化，白藜蘆醇萃取率和分配系數(shù)逐漸增加，當(dāng)無水乙醇與丙酮體積比為2∶1（V/V）時，白藜蘆醇萃取率和分配系數(shù)達(dá)到最大值，此后，隨著（無水乙醇+丙酮）體積比變化，白藜蘆醇萃取率和分配系數(shù)逐漸減小，主要原因是在相同的無機(jī)鹽加入量一定時，無水乙醇的加入量增多，其分相能力增強(qiáng)；但由于乙醇的水化能比較大[10]，無水乙醇的初始加入量過多，將影響體系的分相能力，所以初始加入比例要適當(dāng)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇無水乙醇與丙酮體積比為2∶1（V/V）。

2.2 （無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇萃取的影響

在（無水乙醇+丙酮）/硫酸銨雙水相體系中，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15%、17%、19%、21%、23%的（無水乙醇+丙酮）混合液，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%，加入10%白藜蘆醇粗提液組成雙水相，充分混勻后，靜置分層，測定上下相白藜蘆醇含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 (無水乙醇+丙酮)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.2 Effects of ethanol and acetone concentration on partition coefficient and extraction rate of resveratrol

由圖2可知，當(dāng)（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%時，白藜蘆醇萃取率和分配系數(shù)達(dá)到最大值。這是因?yàn)楫?dāng)兩相體系中（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時，無機(jī)鹽與水分子締合而富集于下相，少量乙醇分子滯留其中。隨著（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，無機(jī)鹽的鹽析作用也相應(yīng)增強(qiáng)，下相中的（無水乙醇+丙酮）分子被逐漸釋放出來[14]，并奪取下相中的水分子與之締合而向上相富集，體系相比隨之增大。但是，當(dāng)（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值時，粗提液中黃酮、齊墩果酸萃取量也會增加，從而抑制白藜蘆醇的萃取率。因此，選擇（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%。

2.3 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇萃取的影響

在（無水乙醇+丙酮）/硫酸銨雙水相體系中，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、22%、24%、26%、28%硫酸銨，（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%，加入10%白藜蘆醇粗提液組成雙水相，充分混勻后，靜置分層，測定上下相白藜蘆醇含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.3 Effects of ammonium sulphate concentration on partition coefficient and extraction rate of resveratrol

由圖3可知，在（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定雙水相體系中，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，白藜蘆醇的萃取率和分配系數(shù)逐漸上升。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%時，萃取率和分配系數(shù)達(dá)到最大值。這是因?yàn)椋o水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時，硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，分相能力也增大，上相中（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)也就隨之增加[15]，而白藜蘆醇在無水乙醇+丙酮中的溶解度比水中的大，所以萃取率和分配系數(shù)增加。因此，選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%。

2.4 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇萃取的影響

在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%（無水乙醇+丙酮）和26%硫酸銨雙水相體系中，分別加入6%、8%、10%、12%、14%白藜蘆醇粗提液組成雙水相，室溫條件下攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對白藜蘆醇分配系數(shù)和萃取率的影響Fig.4 Effects of crude extraction concentration on partition coefficient and extraction rate of resveratrol

由圖4可知，隨著白藜蘆醇粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，白藜蘆醇萃取率和分配系數(shù)逐漸增加，當(dāng)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時，白藜蘆醇萃取率和分配系數(shù)達(dá)到最大，此后，隨著白藜蘆醇粗提液的增加，白藜蘆醇萃取率變化不大。主要原因是當(dāng)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時，白藜蘆醇在有機(jī)相的量達(dá)到飽和，繼續(xù)增加白藜蘆醇粗提液會造成資源浪費(fèi)，因此，選擇粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果

根據(jù)以上單因素的試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面方法進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件。根據(jù)Box-Behnken的組合設(shè)計(jì)原理，以白藜蘆醇萃取率（Y）為響應(yīng)值，對（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）設(shè)計(jì)了3因素3水平的17組試驗(yàn)，其中5組中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。選取的試驗(yàn)因素和水平見表1，試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

表1 白藜蘆醇萃取試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken Design of resveratrol extraction experiment

表2 白藜蘆醇萃取試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Arrangement and results of Box-Behnken Design resveratrol extraction experiment

2.5.1 Box-Benhnken Design試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

利用Design-Expert7.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）與白藜蘆醇萃取率之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

對上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），說明其與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度較好。模型一次項(xiàng)A、B對白藜蘆醇萃取率的線性效應(yīng)極顯著，C對白藜蘆醇萃取率的線性效應(yīng)顯著；二次項(xiàng)A2對白藜蘆醇萃取率的效應(yīng)極顯著；各因子間交互作用均不顯著。模型的確定系數(shù)為0.975 4，說明該模型能解釋97.54%響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化的白藜蘆醇提取工藝是可行的。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析Table 3 Regression analysis of Box-Behnken experiment results

2.5.2 最佳萃取工藝確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）和粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）的交互作用見圖5。對回歸方程進(jìn)行分析得到白藜蘆醇的最佳萃取工藝：（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.29%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.04%、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.55%，預(yù)測萃取率為90.83%。考慮到實(shí)際試驗(yàn)的可操作性，將最佳萃取工藝調(diào)整為（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.3%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.0%、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.6%。按照最佳試驗(yàn)條件重復(fù)試驗(yàn)3次，白藜蘆醇萃取率平均值為89.16%，實(shí)際與預(yù)測的白藜蘆醇萃取率較為接近，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面分析方法適用于白藜蘆醇提取條件的的優(yōu)化。

圖5 各因素兩兩交互作用對白藜蘆醇萃取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of effect of interaction between each two factors on resveratrol extraction rate

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇較優(yōu)水平按Box-Behnken Design試驗(yàn)，通過響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相萃取葡萄皮中白藜蘆醇的最佳工藝條件，經(jīng)回歸方程方差分析及最優(yōu)條件驗(yàn)證，最終獲得：（無水乙醇+丙酮）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.3%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.0%、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.6%，在此條件下，白藜蘆醇的萃取率可達(dá)89.16%。

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Optimization of resveratrol extraction from grape skins with response surface methodology

ZHANG Xifeng,LI Jingya,QIAN Yue,LI Linping,ZHANG Fenqin*
(College of Agriculture and Biotechnology,Hexi University,Zhangye 734000,China)

The optimal conditions for resveratrol extraction were determined by response surface methodology in an aqueous two-phase system. Box-Behnken Design was applied to evaluate the effect of interaction between each two factors between three independent variables(ethanol+acetone concentration,ammonium sulfate concentration,and crude extracted concentration)on resveratrol extraction yield.The optimal conditions for ethanol+acetone concentration,ammonium sulfate concentration,and crude extracted concentration were 22.3%,24.0%,12.6%,respectively.The maximum yield of extracted resveratrol from experiments was 89.16%under the optimal conditions.

aqueous two-phase system;resveratrol;response surface methodology

TQ920.9

A

0254-5071（2014）10-0087-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.021

2014-08-28

河西學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（120）

張喜峰（1982-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。

*通訊作者：張芬琴（1963-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。