獼猴桃灰霉病生防真菌的分離與鑒定

畢金麗，崔艷麗，張靜，袁青峰，劉婭*

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.新疆農業職業技術學院，新疆昌吉831100；3.兵團第十三師農科所，新疆哈密839000）

獼猴桃灰霉病生防真菌的分離與鑒定

畢金麗1，崔艷麗2，張靜3，袁青峰3，劉婭1*

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.新疆農業職業技術學院，新疆昌吉831100；3.兵團第十三師農科所，新疆哈密839000）

為了獲得對獼猴桃灰霉病具有較高拮抗活性的生防菌株，采用系列稀釋法和平板涂布法從獼猴桃果園土壤和健康的獼猴桃果皮表面初步分離篩選到真菌20株；以導致灰霉病的灰霉菌為靶標菌，經平板對峙實驗復篩，發現5株真菌對灰霉病有一定拮抗作用，其中1株編號為HuW1的菌株抑菌直徑最寬，對灰霉病的抑制率最高，達80%左右，形態觀察和ITS rDNA、26S rDNA D1/D2區域序列分析表明該菌株為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

獼猴桃灰霉病；生物防治；拮抗真菌

果蔬采后病害導致的巨大經濟損耗已成為一個全球關注的問題。據有關部門統計，2011年我國約有1億多噸果蔬腐爛，直接損失高達1 000億元，占整個行業產值的30%以上，而美國等發達國家的果蔬采后損失率僅占1.7%～5%[1]。獼猴桃是國內外重要的經濟作物，獼猴桃灰霉病是由灰霉菌（Botrytis cinerea）引起的一種世界性的重要病害，能危害獼猴桃、蕃茄、草莓、黃瓜、葡萄等多種植物，引起果蔬腐爛，損失嚴重。灰霉病菌具有繁殖快，遺傳變異大和適應性強的特點，連續使用同一藥劑易產生抗藥性[2-3]。目前，果蔬采后病害的防治方法主要包括物理法和化學法，物理法生產成本太高，而化學殺菌劑處理存在一定的安全問題[4]，帶來了嚴重的病菌抗藥性與環境污染問題。而微生物防治可以有效的避免這些問題的發生，隨著人們環保意識逐漸提高，對無公害果蔬的需求越來越大，微生物防治日益成為一條重要而有效的途徑[5]。本實驗篩選對灰霉病有拮抗作用的真菌，從而為獼猴桃采后病害的生物防治提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土壤和獼猴桃果實

土壤樣品采自陜西獼猴桃灰霉病發生較重田塊的健康植株根圍土壤。取樣方法參考文獻[6]。

獼猴桃果實為成熟度好、大小均一、無病蟲害的獼猴桃果實。獼猴桃用質量分數2%的次氯酸鈉消毒3 min后用無菌水沖洗，自然晾干后備用[7]。

1.1.2 供試病原菌

病原菌分離于自然發病的獼猴桃果實，并經過純化培養，經形態學鑒定為灰霉菌（Botrytis cinerea）。將病原菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基上，25℃條件下培養至長出菌落。

1.1.3 培養基

（1）PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃滅菌20 min。

（2）培養基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃滅菌20 min。

（3）酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：酵母抽取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值，121℃滅菌20 min。配制YPD固體培養基時加入20 g的瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

“MLS-3780高壓蒸汽滅菌器、MDF-U53F超低溫冰箱：日本三洋公司；ZHJH-C1115C超凈工作臺、ZDP-A2160A全自動新型電熱培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；S1000 PCR儀、Gel Dox XR+凝膠成像系統：美國BIO-RAD公司；XSP-2C雙目生物顯微鏡：上海光學儀器廠；Centrifuge5430低溫離心機：德國Eppendorf公司；HWS-12數顯恒溫水浴鍋：上海一恒儀器有限公司。”

1.3 試驗方法

1.3.1 真菌菌株分離純化與保存

土壤中真菌的分離采用平板涂布法。取適量土壤樣品于無菌水中，充分搖勻后用無菌水按照10倍稀釋度稀釋到不同梯度，涂布到PDA培養基，置于30℃靜置培養，待長出菌落后，將具有典型真菌菌落特征的單菌落挑出，進行分離純化，鏡檢為純種后，于30℃連續傳代培養幾次[8]。對純化的菌株進行編號，并保存在含有15%無菌甘油的凍存管中，-80℃保存。

獼猴桃果皮表面的真菌分離采用常規組織塊法[9]，培養基采用PDA培養基。在超凈臺內進行，選取表面消毒、清洗后的獼猴桃表皮，切取成小塊（每邊長3～4 cm），用無菌操作法將表皮組織移至平板培養基上，30℃靜置培養，待長出菌落后，將具有典型真菌菌落特征的單菌落挑出，進行分離純化，鏡檢為純種后，于30℃連續傳代培養幾次。對純化的菌株進行編號，并保存在含有15%無菌甘油的凍存管中，-80℃保存。

1.3.2 拮抗真菌的篩選

采用平板對峙培養法，以導致灰霉病的灰霉菌為靶標菌，在PDA培養基平板上，靠近中央的位置，做兩個點標記，距離4 cm左右，一個點接灰霉菌菌餅（直徑8 mm），并使菌餅帶菌絲的一面貼在培養基表面，另一點劃線篩選出的真菌，30℃培養24～72 h，測定菌落直徑，計算抑菌率[10-11]。設3次重復。同時以只接有灰霉病原菌的菌餅作為對照（CK）。

1.3.3 拮抗真菌的鑒定

對具有高拮抗活性的真菌，根據菌落特征，并利用光學顯微鏡觀察菌體，結合ITS rDNA和26S rDNA D1/D2區域序列分析，確定其分類學地位[12-14]。

ITS序列擴增引物為ITS1（5′-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3′），PCR程序為：94℃預變性、5 min；94℃變性、30 s，57℃退火、45 s，72℃延伸、1 min，35個循環；72℃、10 min。26S rDNA D1/D2區域序列擴增引物為NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′），PCR程序為：94℃預變性、5 min；94℃變性、30 s，55℃退火、45 s，72℃延伸、1 min，35個循環；72℃、10 min。PCR產物克隆到pMD18-T Simple載體后進行測序。所有序列的測定：由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。結合ITS序列和26S rDNA D1/D2區域序列在NCBI的BLAST比對結果和菌落、菌體細胞形態對拮抗真菌進行分類學鑒定[8，14-15]。

2 結果與分析

2.1 真菌菌株分離純化

以土壤和獼猴桃果皮表面為拮抗真菌篩選來源，經初篩，共分離到20株真菌，其中源自土壤的菌株12株，源自獼猴桃果皮表面的菌株8株。

2.2 拮抗真菌的篩選

將分離到的20株真菌用于獼猴桃灰霉病潛在生防菌的篩選。分別在PDA培養基和YPD培養基上培養，通過復篩，發現有5株真菌對獼猴桃灰霉病具有一定的拮抗活性。根據平板對峙培養過程中抑菌寬帶長短，篩選出一株拮抗活性最高的菌株，編號為HuW1（源自獼猴桃果皮表面），其抑菌圈透明、邊緣清晰、界限明顯，且在接灰霉菌后的3 d內具有一定的穩定性，72 h后抑菌直徑達到33 mm左右，抑制率達80%左右，結果見圖1。

圖1 菌株HuW1與獼猴桃灰霉菌平板對峙實驗效果Fig.1 Results of plate confrontation test between strain HuW1 and kiwi Botrytis cinerea

2.3 拮抗真菌的鑒定

2.3.1 形態鑒定

菌株HuW1在PDA培養基和YPD培養基上的菌落特征為菌落大且厚，表面濕潤、透明、光滑、易被挑起，為乳白色，具有酵母菌落的典型特征，結果見圖2。

利用光學顯微鏡觀察菌株HuW1的菌體形態，菌體呈橢圓形，有子囊和孢子，具有酵母菌細胞的典型特征，如圖3所示。

圖2 菌株HuW1在PDA培養基(A)和YPD培養基(B)的菌落形態Fig.2 Colony morphology of strain HuW1 in PDA medium(A) and YPD medium(B)

圖3 菌株HuW1的細胞形態特征Fig.3 Cells morphology of strain HuW1

2.3.2 分子鑒定

HuW1 PCR擴增獲得747 bp的ITS序列如下：

HuW1 PCR擴增獲得615 bp的26S rDNA D1/D2區域序列如下：

將所獲得的序列與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比對，ITS和26S r DNA D1/D2區域序列與數據庫中的Hanseniaspora uvarum和Hanseniaspora opuntiae的同源性為100%。

結合序列比對結果和菌落、菌體形態特征，最終將此菌株鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

3 結論

本實驗從健康的獼猴桃果皮表面分離到1株對灰霉病抑制效果較好的菌株HuW1，抑制率約為80%。經形態和分子生物學鑒定，確定該菌為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

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Isolation and identification of biocontrol fungi against kiwi Botrytis cinerea

BI Jinli1,CUI Yanli2,ZHANG Jing3,YUAN Qingfeng3,LIU Ya1*
(1.College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.XinJiang Agricultural Vocational and Technical College, Changji 831100,China;3.Institute of Agricultural Sciences of 13 Division Corps,Hami 839000,China)

In order to get bio-control strains with high antagonism activity against kiwi Botrytis cinerea,20 fungi strains were isolated and screened from kiwi fruit orchard soil and the surface of the health kiwi fruit by serial dilution method and spread plate method.Using B.cinerea as target strain,after affination of plate confrontation test,five strains with certain antagonistic activity against the growth of B.cinerea were found through the confrontation experiments.The bacteriostatic diameter of one strain named HuW1 was the widest,and the inhibition ratio against B.cinerea was about 80%.According to the BLAST results of ITS and 26S rDNA D1/D2 domain sequences and the morphology of the colony and cells,this strain was identified to be Hanseniaspora uvarum.

kiwi Botrytis cinerea;biocontrol;antagonistic fungi

S182

A

0254-5071（2014）10-0084-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.020

2014-05-19

兵團博士資金專項（2014BB006）

畢金麗（1987-），女，碩士，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：劉婭（1974-），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。