紅曲霉固態發酵產洛伐他汀的響應面優化

鄭虹

（福建師范大學福清分校海洋與生化工程學院，福建福清350300）

紅曲霉固態發酵產洛伐他汀的響應面優化

鄭虹

（福建師范大學福清分校海洋與生化工程學院，福建福清350300）

采用Box-Benhnken試驗設計和響應面分析，對紅曲霉固態發酵產洛伐他汀的工藝條件進行優化，得到最佳的發酵工藝條件為培養時間、初始含水量和大米裝量分別為17 d、25.4%、53.3 g/250 mL，在此條件下，洛伐他汀的產量可達15.35 mg/g，與預測值(14.73 mg/g)較為接近。結果表明響應面法優化紅曲霉固態發酵產洛伐他汀的條件合理可行。

紅曲霉；洛伐他?。还虘B發酵；響應面分析

紅曲霉（Monascus ruber）屬于真菌門，子囊菌亞門，不整囊菌綱，散囊菌目，紅曲科，紅曲霉屬。紅曲霉能產食用色素，在我國具有上千年的食用歷史，在食品著色、食品防腐及醫療上具有廣泛的應用前景[1-6]。近年來國內外在紅曲霉的研究過程中主要是集中在菌種選育、培養基優化、發酵工藝和提取測定方法等方面[7-13]。紅曲霉能夠產生多種活性代謝物質，主要有紅曲色素、麥角固醇、γ-氨基丁酸、洛伐他汀類化合物及其他活性產物等[14]。

紅曲霉所產生的洛伐他汀不僅能夠抑制膽固醇的合成還能增加膽固醇的分解代謝[15]。此外，洛伐他汀在多項藥理實驗研究結果還表明，其對腎臟具有保護作用；能預防和治療膽結石、抗腫瘤、刺激骨骼形成；對動脈硬化、糖尿病都有很好的治療作用[16]。洛伐他汀引起了廣大國內外專家學者的研究興趣，并分別對其功能性、安全性以及作用機理、分子結構、代新途徑等宏觀與微觀水平上進行了深入研究，并取得了引人注目的成果[17-18]。但我國對洛伐他汀類藥物開發較晚，在產率和提取率上與發達國家有較大差距。本研究利用響應面法對紅曲霉產洛伐他汀發酵培養條件進行優化，對提高發酵水平，降低成本具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉（Monascus ruber）：由本實驗室篩選并保藏。

1.1.2 培養基

（1）斜面培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂15～20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

（2）種子培養基：葡萄糖50 g，蛋白胨10 g，NaNO35 g，MgSO41 g，KH2PO41 g，水1 000 mL，pH自然。121℃滅菌20 min。

（3）發酵培養基：丁優米50 g，初始含水量50%。121℃滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

丁優米：超市；洛伐他汀標準品：美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1750紫外可見分光光度計：日本島津公司；GSP-9050MBE隔水式恒溫培養箱：上海博訊實業有限公司；LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；H1850臺式高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；THZ臺式恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅曲霉活化及種子液制備

4℃冰箱保存的紅曲霉接種于新鮮的斜面培養基上，30℃恒溫培養5 d；挑取1～2環孢子接種于種子培養基，30℃、120 r/min振蕩培養5 d。

1.3.2 單因素試驗

大米裝量對紅曲霉洛伐他汀產量的影響：250 mL三角瓶中分別裝20 g、30 g、40 g、50 g、60 g、70 g、80 g的大米，按5%的接種量接入種子液，30℃靜置培養18 d，測定發酵培養物中洛伐他汀的含量。

培養時間對紅曲霉洛伐他汀產量的影響：按5%的接種量接入種子液，以大米的裝量為30 g，30℃靜置培養8 d后，每隔2 d取樣，測定發酵培養物中洛伐他汀的含量。

初始含水量對紅曲霉洛伐他汀產量的影響：在發酵培養基中添加不同的蒸餾水，使培養基的初始含水量達到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%，按5%的接種量接入種子液，以大米的裝量為30 g，30℃靜置培養18 d，測定發酵培養物中洛伐他汀的含量。

以上每個試驗重復3次，數據處理采用DPS和Excel軟件處理。

1.3.3 響應面試驗設計

采用Design Expert 8.05軟件設計試驗[19-20]。采用Box-Benhnken的中心組合試驗設計，在單因素試驗基礎上，選取培養時間、初始含水量、大米裝量3個因子，設計3因素3水平的響應面分析試驗，因素及水平見表1。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels for BBD experiments

1.3.4 樣品中洛伐他汀的含量測定

采用雙波長紫外分光光度計法[21]測定樣品中洛伐他汀的含量。

標準曲線的繪制：稱取洛伐他汀標準品64 mg，用體積分數為75%乙醇配制成64 mg/mL的母液，分別吸取一定量母液，用體積分數為75%乙醇配制稀釋液質量濃度為3.2 mg/mL、6.4 mg/mL、9.6 mg/mL、12.8 mg/mL、16.0 mg/mL、19.2 mg/mL、22.4mg/mL、25.6 mg/mL、28.8mg/mL、32.0 mg/mL。用雙波長的方法測定各稀釋液的吸光度值A264nm和A254nm，并求其二者差值△A（A264nm-A254nm）。

樣品中洛伐他汀的測定：稱取0.2 g發酵培養物，用20 mL體積分數為75%的乙醇于超聲波提取2 h，5 000 r/min、4℃離心10 min除去不溶雜質，收集取上清液，上清液進行吸附層析除去色素和雜質，流出液定容至100 mL，測定溶液的A264nm和A254nm，求其二者差值△A（A264nm-A254nm），通過標準曲線求得樣品中洛伐他汀的含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸方程的建立

以洛伐他汀質量濃度（x）為橫坐標，△A為縱坐標（y）繪制標準曲線，結果見圖1。

圖1 洛伐他汀標準曲線Fig.1 Standard curve of lovastatin

由圖1可知，標準曲線回歸方程為y=0.049 1 x-0.024 3，相關系數R2為0.999 7，表明二者線性關系良好。

2.2 單因素對紅曲霉洛伐他汀產量的影響

2.2.1 大米裝量對紅曲霉洛伐他汀產量的影響

250 mL三角瓶中分別裝20 g、30 g、40 g、50 g、60 g、70 g、80 g的大米，將活化后種子液按5%接種量接種于發酵培養基，30℃靜置培養18 d，測定發酵培養物中洛伐他汀的含量，結果見圖2。

物料的裝量是固態發酵的關鍵因素之一，裝量太多，通氣性不好，不利于發酵過程的散熱；同樣裝量太少，造成資源浪費。由圖2可知，洛伐他汀產量隨著大米量的增加而增加，當大米裝量為30 g時，洛伐他汀產量達到最大值為7.81 mg/g，之后隨著大米裝量的增加，洛伐他汀的產量反而逐漸減少。微生物在生長過程中會產生大量的熱量，對于固態發酵，物料是靜置的，培養基的傳熱性能較差，只有當試驗容器內裝有合適量的大米時，才有利于紅曲霉洛伐他汀的合成。因此試驗中以大米的裝量為30 g/250 mL時最佳。

2.2.2 培養時間對紅曲霉洛伐他汀產量的影響

以大米的裝量為30 g/250 mL，30℃靜置發酵培養至8 d后，每隔2 d測定發酵培養物中洛伐他汀的含量，結果見圖3。

圖3 培養時間對洛伐他汀產量的影響Fig.3 Effect of culture time on lovastatin yield

紅曲霉積累產物的過程是一個動態的過程。由圖3可知，紅曲霉產洛伐他汀的量剛開始隨培養時間的延長而增加，當培養至18 d時，洛伐他汀含量達到最大值為12.96 mg/g，之后隨著時間的延長，洛伐他汀含量反而減少，因此發酵時間就以18 d為最適。

2.2.3 初始含水量對紅曲霉洛伐他汀產量的影響

將種子液按5%接種量接種于不同初始含水量的發酵培養基，以大米的裝量為30 g/250 mL，30℃靜置培養時間為18 d，測定發酵培養物中洛伐他汀的含量，結果見圖4。

圖4 初始含水量對洛伐他汀產量的影響Fig.4 Effect of initial water content on lovastatin yield

初始含水量是影響菌株固態發酵的主要因素之一，因此研究了初始含水量對紅曲霉洛伐他汀產量的影響。由圖4可知，紅曲霉產洛伐他汀含量先是隨培養基中初始含水量的增加而增加，直到初始含水量為20%時，洛伐他汀含量達到最大值，即14.15 mg/g，之后洛伐他汀含量隨著初始含水量的增加反而減少。可能是由于培養基主要成分是大米，初始含水量越高，大米的黏度越大，大米黏度太大不利于紅曲霉菌絲的生長，進而影響到洛伐他汀的積累，最佳的初始含水量使大米達到一個松而不黏的狀態。結果表明，當初始含水量為20%時，大米松而不黏，因而有利于紅曲霉洛伐他汀的積累。

2.3 響應面分析法優化發酵工藝

2.3.1 二次回歸擬合及方差分析

根據單因素試驗結果，選擇培養時間（X1）、初始含水量（X2）、大米裝量（X3）3個因素為變量，洛伐他汀產量（Y）為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗，試驗方案及結果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設計與結果Table2 Design and results of Box-Behnken design

利用軟件對表2數據進行二次多項回歸擬合，獲得二次多項回歸方程：

對上述回歸模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，回歸模型的P=0.008 7，失擬P=0.477 5，回歸極顯著，失擬不顯著，說明所創建的模式合適。該模型的校正系數R2Adj=0.772 7，說明該方程與實際情況擬合較好，預測值和實際值的相關性較高，可用該模型對紅曲霉固態發酵產洛伐他汀的最優發酵條件進行理論預測。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Variance analysis of response surface quadratic model

由回歸方程各項方差分析表明，大米裝量對洛伐他汀產量影響顯著，而培養時間與初始含水量之間的交互作用對洛伐他汀產量的影響不顯著，培養時間與大米裝量、初始含水量與大米裝量之間交互作用不顯著。同時由軟件分析得出模型的極值點，當培養時間為17 d，初始含水量為25.4%，大米裝量為53.3 g/250 mL時，洛伐他汀產量的理論預測最大值為14.73 mg/g。

2.3.2 響應面及其等高線圖

利用軟件Design Expert 8.05繪制出響應面及等高線圖。結果見圖5。

圖5反映了培養時間、初始含水量、大米裝量3個因素的兩兩交互作用對洛伐他汀產量的影響。由圖5可知，培養時間與初始含水量、培養時間與大米裝量、初始含水量與大米裝量的等高線呈橢圓形，兩兩因素間交互作用顯著。

2.4 回歸模型的驗證試驗

圖5 各因素交互作用對洛伐他汀產量影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effect of interaction between each factors on lovastatin yield

為了檢驗模型的可行性，在預測最佳條件下進行發酵試驗。紅曲霉在優化發酵工藝條件下，洛伐他汀產量可達到15.35 mg/g，比優化前（5.52 mg/g）提高了1.8倍，與理論預測值（14.73 mg/g）較為接近，表明預測值與實際值有較好的擬合性，可見該模型可用于預測紅曲霉固態發酵產洛伐他汀的實際發酵情況。

3 結論

在單因素試驗基礎上，利用響應面法對紅曲霉固態發酵產洛伐他汀的發酵條件進行優化，運用軟件Design Expert 8.05建立了洛伐他汀產量與培養時間、初始含水量、大米裝量3個因素的二次多項式回歸模型，經驗證試驗證明該模型的理論預測值與實際值有較好的擬合性，說明該模型可用于紅曲霉發酵產洛伐他汀的試驗預測。并得出最優發酵條件，即培養時間為17 d，初始含水量為25.4%，大米裝量為53.3 g/250 mL，在此條件下，洛伐他汀的產量達到15.35 mg/g，比優化前提高了1.8倍。

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Optimization of solid-state fermentation conditions of Monascus for lovastatin production by response surface methodology

ZHENG Hong
(School of Ocean Science and Biochemistry Engineering,Fuqing Branch of Fujian Normal University,Fuqing 350300,China)

In order to optimize the solid-state fermentation of Monascus for lovastatin production response surface methodology(RSM)and Box-Behnken design analysis was employed.The results showed that the optimized conditions were fermentation time 17 d,initial water content 25.4%, and rice content 53.3 g/250 ml.Under this condition,the highest lovastatin production was 15.35 mg/g,close to the predicted value 14.73 mg/g.This study proved that RSM could be efficiently applied in optimizing the solid-state fermentation conditions of Monascus for lovastatin production.

Monascus;lovastatin;solid-state;response surface methodology

TQ920.1

A

0254-5071（2014）10-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.018

2014-08-21

福建師范大學福清分校省級重點學科建設基金項目（20120326）

鄭虹（1981-），女，實驗師，碩士，研究方向為微生物發酵。