川藏高原冰葡萄中五種酵母菌的鑒定及耐受性研究

蔣麗，邢亞閣，車振明*，孫叢珊，羅建峰

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院食品生物技術(shù)重點實驗室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

川藏高原冰葡萄中五種酵母菌的鑒定及耐受性研究

蔣麗1，邢亞閣1，車振明1*，孫叢珊1，羅建峰2

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院食品生物技術(shù)重點實驗室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

從川藏高原地區(qū)采摘的冰葡萄果實中分離純化出了葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）5種菌株，采用18S rDNA D1/D2序列對菌株進行了鑒定，并對其耐受性進行了研究比較。結(jié)果表明：葡萄汁有孢漢遜酵母對蔗糖、乙醇和堿表現(xiàn)出較強的耐受性；釀酒酵母對酸表現(xiàn)出相對較好的耐受性；異常威克漢姆酵母對低溫和二氧化硫表現(xiàn)出較強的耐受性。

冰葡萄；耐受性；分離鑒定

國際科學(xué)組織中對冰葡萄酒的定義是：將葡萄推遲采收，當(dāng)氣溫低于-8℃使葡萄在樹枝上保持一定時間，結(jié)冰，采收，在結(jié)冰狀態(tài)下壓榨、發(fā)酵，釀制而成的葡萄酒[1]。加拿大酒商質(zhì)量聯(lián)盟（vintners quality alliance，VQA）標(biāo)準(zhǔn)的定義是：氣溫-8℃以下，在葡萄樹上自然冰凍的葡萄釀造的葡萄酒。冰葡萄酒有雷司令（Riesling）、威代爾（Vidal）、長相思（Sauvigon）、貴人香（Italian Riesling）等[2]。酵母菌是分屬于子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、半知菌類的單細(xì)胞真菌微生物[3]。對于冰葡萄酒的釀造，酵母菌的作用必不可少。這些酵母菌主要來自葡萄漿果表面、土壤、酒廠設(shè)備以及人工接種[4-6]。冰葡萄酒相關(guān)酵母菌的生物多樣性及種群構(gòu)成是選育優(yōu)良釀酒酵母菌中的基礎(chǔ)與關(guān)鍵[7-8]，因此，研究不同酵母菌的種類及菌群動態(tài)變化，有利于在發(fā)酵過程中合理調(diào)控微生物，最大限度的發(fā)揮各類酵母菌的優(yōu)點，促進優(yōu)質(zhì)冰葡萄酒品質(zhì)的形成[9]。目前，對威代爾冰葡萄中畢赤酵母菌的耐受性進行初步的研究[10]以及對威代爾冰葡萄中酵母菌的分離、篩選及其耐受性作了初步研究[11]。真正優(yōu)良的葡萄酒酵母，應(yīng)具備起酵快，能耐乙醇、高濃度二氧化硫、低溫等優(yōu)點[12]。

利用基因測序方法，通過對威代爾冰葡萄汁發(fā)酵過程中的酵母菌葡萄汁有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、釀酒酵母、解脂耶羅維亞酵母和異常威克漢姆酵母五種菌株進行了分離鑒定，并進一步研究了該五種菌株的耐低溫、耐酸堿、耐SO2和糖等性能，為川西藏區(qū)冰葡萄酒擴大生產(chǎn)提供了一定的技術(shù)支持，對川西高原冰葡萄酒行業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

冰葡萄：由四川阿壩州理縣塔斯酒莊提供；體積分?jǐn)?shù)為98%乙醇、94%亞硫酸、20%甘油、氯化鎂等化學(xué)試劑：成都科龍化工廠；酵母菌18S rDNA序列分析和電泳檢測所用試劑：成都東勝公司。

1.1.2 培養(yǎng)液與培養(yǎng)基[13]

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)液：馬鈴薯20%，葡萄糖2%。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%。磷酸二氫鉀0.055%，氯化鉀0.042 5%，氯化鈣0.012 5%，氯化鐵0.000 25%，硫酸鎂0.012 5%，硫酸錳0.000 25%，溴甲酚綠0.002 2%，將上述成分配好后加熱溶解，pH 6.5，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實驗儀器公司；721分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-B型恒溫振蕩箱：金壇市富華儀器有限公司；pHS-25精密pH計：上海精科雷磁儀器廠；DYY-8型雙定時電泳儀：鄭州朋來儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離

從酒莊運至實驗室的威代爾冰葡萄進行榨汁處理，用WL培養(yǎng)基從葡萄汁中篩選出生長旺盛且特征明顯的5株菌，通過平板劃線分離出該五株菌的單菌落（分別對五株菌進行編號：JH、JH1、JH2、JH3、JH4）。挑取單菌落在液體PDA培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后用甘油保存菌株，放置在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株分子鑒定

采用18S rDNA序列分析法對分離出的菌株進行分子鑒定。采用玻璃珠法[14]提取基因組總DNA：聚合酶連反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系為30 μL重蒸水，5 μL 10×PCR擴增緩沖液，6 μL MgCl2（25 mmol/L），4 μL三磷酸脫氧核苷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L），正向引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和反向引物NS8（5′-TCCGCAGGTTC ACCTACGGA-3′）各1μL，1μL Tap聚合酶（2.5 U/μL），2μL總DNA模板。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，經(jīng)30個循環(huán)后最終72℃保持10 min，然后等溫度降到4℃停止運行。

1.3.3 耐受性實驗

由于細(xì)菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計測定細(xì)菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，因此可以反應(yīng)菌的生長狀況。

（1）耐糖性分析：將實驗菌株活化好接種不同的蔗糖含量（5%、25%、40%、55%、70%）的培養(yǎng)液中，接種量為1.0×108CFU/mL，25℃培養(yǎng)24 h，在波長600 nm處測其吸光度值。以不加菌液的YPD培養(yǎng)液為空白對照。

（2）耐酸堿性分析：根據(jù)葡萄汁的pH值，將實驗菌株分別采用不同的pH值（1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0）在25℃培養(yǎng)24 h，接種量為1.0×108CFU/mL，在波長600 nm處測其吸光度值，空白對照同上。

（3）耐溫性分析：將實驗菌株活化后接種于帶有杜氏管的YPD培養(yǎng)液中，接種量為1.0×108CFU/mL，然后分別放于8℃、15℃、20℃、28℃、32℃條件下培養(yǎng)24 h，在波長600 nm條件下測其吸光度值，空白對照同上。

（4）耐二氧化硫分析：將實驗菌株分別采用不同的二氧化硫質(zhì)量濃度（100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L）在25℃培養(yǎng)24 h，在波長600 nm處測其吸光度值，空白對照同上。

（5）耐乙醇分析：將實驗菌株分別采用不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)（4%、8%、12%、16%、20%）在25℃培養(yǎng)24 h，在波長600 nm處測其吸光度值，空白對照同上。

1.3.4 理化指標(biāo)檢測

pH的測定采用pH計法；二氧化硫含量采用碘吸收滴定法進行測定[16]（采用亞硫酸鈉進行二氧化硫濃度調(diào)節(jié)）；蔗糖含量、乙醇含量采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 五株酵母菌的分離鑒定

圖1 目的基因擴增電泳圖(瓊脂糖1%)Fig.1 PCR electrophoretogram of target gene(agarose 1%)

標(biāo)準(zhǔn)品基因和目的基因擴增電泳結(jié)果見圖1。由圖1電泳結(jié)果可知，對樣本的18S rDNA基因進行PCR擴增，所擴增片段的大小約為1.8 kb，和真核生物的18S rRNA/DNA基因片段大小一致，因此達(dá)到了對酵母的18S rDNA基因的PCR擴增目的。通過基因測序，采用BLAST和ClustalX程序與GenBank中以收錄的酵母18S rDNA D1/D2區(qū)序列比對，鑒定出JH、JH1、JH2、JH3、JH4五種菌株分別為葡萄汁有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、釀酒酵母、解脂耶羅維亞酵母、異常威克漢姆酵母。

2.2 酵母菌耐糖性分析

對于冰葡萄酒而言，在發(fā)酵初期，發(fā)酵液的糖度較高，達(dá)到38°Bx，但隨著發(fā)酵的進行，殘?zhí)堑南陆邓俣纫蚕鄬^快，因此酵母菌應(yīng)該具有一定的耐糖性能，才能使冰葡萄酒的發(fā)酵順利進行，不同蔗糖含量對酵母菌活性的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，5株菌的吸光度值都隨著糖含量升高而降低，說明其生長都受到抑制。在蔗糖含量為70%時，該實驗的五種菌株都有生長的跡象，但酵母菌的生長明顯受到抑制，這五種菌的糖耐受性大小為JH＞JH2＞JH1＞JH4＞JH3。結(jié)果表明：這五種酵母菌對蔗糖都有一定的耐受性，JH的耐受性（其吸光度值為0.194）比其他四種酵母菌的耐受性強，JH3的耐受性最差（其吸光度值為0.058）。

圖2 不同蔗糖含量對酵母菌活性的影響Fig.2 Effect of different sucrose concentration on activity of yeasts

2.3 酵母菌耐酸堿性分析

圖3 不同的pH值對酵母菌活性的影響Fig.3 Effect of different pH value on yeasts activity

在葡萄酒釀造過程中，許多生化反應(yīng)取決于pH值的大小而不是總酸。pH值的高低直接影響葡萄酒的感官質(zhì)量和葡萄酒的生產(chǎn)工藝，對于研究酵母菌耐pH值的分析尤為重要。不同的pH值對酵母菌活性的影響見圖3。由圖3可知，JH3在各個pH值時，其生長狀況比其他四種菌表現(xiàn)差，在pH值為1.5時，JH2（其吸光度值為0.112）生長狀況最好，耐受性大小為JH2＞JH4＞JH1＞JH＞JH3；在pH為14時JH菌生長狀況最好，其酸堿耐受性大小為JH＞JH4＞JH2＞JH1＞JH3。結(jié)果表明：這五種菌都有一定的耐酸堿性能，同一種酵母菌對酸和堿的耐受性不同，耐堿性比耐酸性強。

2.4 酵母菌耐低溫性分析

在四川高原藏區(qū)，冰葡萄酒的發(fā)酵溫度一般控制在10℃左右，而酵母菌發(fā)酵的最適溫度高于此溫度，這樣使得冰葡萄酒原料能夠在一定的低溫條件進行長時間發(fā)酵，以此可以獲得較好的冰葡萄酒品質(zhì)。將分離純化好的酵母菌接種于YPD培養(yǎng)液中，于不同的溫度下培養(yǎng)，5株菌都隨著溫度的升高，其細(xì)胞數(shù)增加，結(jié)果見圖4。由圖4可知，該酵母菌在8℃下培養(yǎng)，其吸光度值分別為是0.605、0.735、0.635、0.365、0.786，表明該五種菌仍然有一定的生長能力，耐低溫性大小為JH4＞JH1＞JH2＞JH＞JH3。結(jié)果表明，這五種酵母菌都具備低溫發(fā)酵的能力，且最適發(fā)酵溫度為28℃。

圖4 不同的溫度對酵母菌活性的影響Fig.4 Effect of different temperature on yeasts activity

2.5 酵母菌耐二氧化硫分析

圖5 不同的二氧化硫質(zhì)量濃度對酵母菌活性的影響Fig.5 Effect of different sulfur dioxide concentration on yeasts activity

在冰葡萄酒釀造過程中二氧化硫作為葡萄酒中十分重要的添加劑，它在葡萄酒的生產(chǎn)和貯藏中占有不可取代的地位。可以凈化發(fā)酵基質(zhì)、提高葡萄酒酒精度、提高有機酸含量、降低揮發(fā)酸含量，增加色度，改善葡萄酒的味感質(zhì)量等。將分離純化好的五株酵母菌分別接種于含不同二氧化硫質(zhì)量濃度的YPD液體培養(yǎng)基中，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在高二氧化硫質(zhì)量濃度700 mg/L時，JH的生長受到抑制作用明顯；JH4和JH2生長表現(xiàn)良好，其他菌也有生長的跡象。結(jié)果表明，該五種酵母菌都耐一定質(zhì)量濃度的二氧化硫，且JH4菌耐受性能最高。

2.6 酵母菌耐乙醇分析

在冰葡萄酒釀造中，隨著發(fā)酵的進行，葡萄醪中的酒精度會有一定的變化。不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對酵母菌活性的影響見圖6。由圖6可知，五株菌的吸光度值都隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而減少，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時，JH生長良好，吸光度值為0.105；JH3明顯受到抑制，吸光度值為0.051，其他菌在此體積分?jǐn)?shù)下也有生長的跡象。結(jié)果表明，該五種菌對乙醇都具有一定的耐受性，JH耐乙醇性能最好。

圖6 不同乙醇的體積分?jǐn)?shù)對酵母菌活性的影響Fig.6 Effect of different ethanol concentration on yeasts activity

3 結(jié)論

該文研究了從四川藏區(qū)高原威代爾冰葡萄果實中分離純化出的菌株葡萄汁有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、釀酒酵母、解脂耶羅維亞酵母、異常威克漢姆酵母，并采用18S rDNA D1/D2進行了基因鑒定。通過對這五種酵母菌耐受性實驗分析，鑒定出的五種菌株分別在pH值為1.5和14.0的條件下均有一定的生長能力；在蔗糖含量70%條件下具有一定的生存能力；在8℃低溫條件下時，雖然生長受到抑制，但是仍然表現(xiàn)有一定的生長率；在二氧化硫質(zhì)量濃度為700 mg/L下和乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%的條件下，仍然有生長的跡象。結(jié)果表明，五株菌對乙醇、pH、蔗糖、低溫、二氧化硫具有一定的耐受性，其中葡萄汁有孢漢遜酵母對蔗糖、乙醇和堿表現(xiàn)出較強的耐受性；釀酒酵母對酸表現(xiàn)出相對較好的耐受性；異常威克漢姆酵母對低溫和二氧化硫表現(xiàn)出較強的耐受性。綜合考慮，釀酒酵母對蔗糖、酸、二氧化硫、乙醇以及低溫的耐受性最好。

此研究對篩選川西冰葡萄酒產(chǎn)區(qū)特色酵母菌，并構(gòu)建出冰葡萄酒發(fā)酵微生物資源庫具有重要意義。由于形成冰葡萄酒特有風(fēng)味品質(zhì)的發(fā)酵微生物菌群是相當(dāng)復(fù)雜，研究仍然在繼續(xù)，以期為川西藏區(qū)冰葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

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Identification and tolerance properties of five kinds of yeasts in ice grapes in Sichuan Tibet Plateau

JIANG LI1,XING Yage1,CHE Zhenming1*,SUN Congshan1,LUO Jianfeng2
(1.Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.Lixian Tasi Chateau Co.,Ltd.,Ngawa Prefecture 623100,China)

Hanseniaspora uvarum,Metschnikowia pulcherrima,Saccharomyces cerevisiae,Yarrowia lipolytica and Wickerhamomyces anomalus were isolated and purified from the fermentation process of the Sichuan Tibetan Plateau ice grape.Strains were identified by 18S rDNA D1/D2,and their tolerance were also studied and compared.Results showed the H.uvarum had strong tolerance capacity against sucrose,ethanol,and alkali,the Y.lipolytica had good tolerance capacity against acid,and W.anomalus had better tolerance capacity against low temperature and sulfur dioxide.

ice grape;tolerance;isolation and identification

TS261.1

A

0254-5071（2014）10-0036-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.009

2014-08-25

省科技支撐計劃項目（2011SZ0284、2012SZ0117、13KCBZ0066）；2012年西華大學(xué)食品生物技術(shù)重點實驗室開放研究基金資助項目（SZjj2012-005）；2013年西華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項目（ycjj201346）

蔣麗（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。

*通訊作者：車振明（1960-），男，教授，本科，研究方向為食品發(fā)酵技術(shù)。