Cu2+對釀酒酵母酒精發酵影響的研究進展

賈博，戰吉宬，黃衛東

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

Cu2+對釀酒酵母酒精發酵影響的研究進展

賈博，戰吉宬，黃衛東*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

銅制劑農藥應用歷史悠久，可有效的防治葡萄霜霉、白粉等病害，在全球葡萄園中使用頻繁和廣泛。不合理使用銅制劑農藥會引起葡萄果實的銅污染，升高葡萄汁的銅含量，進而影響釀酒酵母正常的酒精發酵，最終影響葡萄酒的品質。綜述了Cu2+對釀酒酵母生長活性和酒精發酵影響的研究進展，并針對已取得的研究成果進行展望，旨在為Cu2+對釀酒酵母影響的深入研究提供參考。

Cu2+；釀酒酵母；生長活性；酒精發酵

銅制劑農藥在全球應用廣泛（如波爾多液[CuSO4· xCu（OH）2·yCa（OH）2·zH2O]），自問世以來，一直被廣泛用于防治葡萄的霜霉、白粉等病害[1-2]。根據世界銅發展大會的統計結果，硫酸銅作為銅制劑農藥的重要組成成分，全球每年的使用量可達到150 000 t。銅制劑農藥被大劑量和無限制地使用，致使早在19世紀末期，某些地區葡萄園中的土壤富集了大量的銅，主要以二價陽離子形式存在[2]。由于銅既不會降解，又很少移動，進入環境后主要集中在土壤的耕作層，長期積累在土壤中的銅離子被植物的根吸收進入植物體內，使植物器官的含銅量增加，過量的銅會影響植物的正常生長[3]。銅污染跟銅制劑施用的方式方法有著直接的關系[4]。LA PERA L等[5]發現，在葡萄園中施用銅制劑（CuCl2·xCuO·4H2O）升高了葡萄果實的含銅量，從而直接導致發酵液中的銅含量增加。發酵過程中，長時間接觸銅器具，也會增加發酵液中的含銅量[6]。當發酵液中Cu2+超過一定含量時，會影響釀酒酵母的正常生長和酒精發酵[7]。

釀酒酵母是葡萄酒釀造中的關鍵因子，抗銅性是篩選優良釀酒酵母的重要指標之一。因此，研究Cu2+對釀酒酵母生長、發酵性能的影響對解決葡萄酒生產中的銅問題有著十分重要的意義。本文就酵母對銅的吸收、轉運以及銅對酵母生長和酒精發酵的影響進行了綜述，并就Cu2+對酵母影響的研究提出了展望。

1 銅對釀酒酵母活性的影響

銅普遍存在于動物、植物和微生物體內，是維持生命體正常生長與代謝的重要微量元素，參與多種生命活動，其主要的生理功能表現在：它是許多酶和蛋白所必需的組分，其中包括有Cu/Zn超氧化物歧化酶、細胞色素氧化酶、酪氨酸酶、賴氨酰氧化酶和血漿銅藍蛋白等[8-9]。許多參與氧化還原反應的蛋白質活性位點上的銅是有效的電子供體與受體，同時，許多具有氧化功能的酶，需要有銅存在時才有活性。但是銅過量時，就成了氧化還原反應的活潑因子，參與Fenton反應，產生有害的氫氧根離子，氫氧根離子會引起細胞膜脂質的過氧化、蛋白質的氧化以及DNA和RNA分子的解鏈，最終導致細胞的死亡[10]。

1.1 釀酒酵母對銅的吸收、轉運、代謝及吸附

酵母細胞內的銅離子主要分布在細胞質、高爾基體、線粒體和液泡中。銅在自然界中多以二價形式存在。二價銅在被酵母吸收之前，首先由細胞質膜上FRE1和FRE2基因編碼的鐵還原酶（FRE1、FRE2）還原為一價銅離子。一價銅離子再通過高親和（CTR1、CTR3）和低親和（CTR2、FET4）轉運系統進入細胞內部[11-12]。培養基中的銅可以調控CTR1、CTR2、CTR3的表達，低銅條件下，CTR1、CTR3表達加強。銅過量時，CTR1、CTR3表達受抑制，CTR1會出現降解[13]，而CTR3不會[12]。FET4對包括銅、鋅在內的其他金屬離子，也具有吸收功能[14]。CTR2對胞內儲備銅起一定的作用[15]，CTR2不是銅轉運所必需的，甚至在CTR1、CTR3雙缺失的菌株中也不是必需的。MAC1起上調和下調以上基因的作用[16]。

銅離子在細胞內與特異的銅伴侶蛋白（copper chaperone protein）結合，再輸送至各目標亞細胞器，銅伴侶蛋白可以降低銅在細胞內的毒性，現階段，ATX1、COX17、LYS7三個銅伴侶蛋白的功能研究的較為清楚，ATX1將銅離子從細胞膜上的CTR1轉運至分泌途徑中位于后高爾基體囊泡的CCC2，最終運送至細胞表面的高親和鐵吸收蛋白FET3[17]；通過COX17，銅離子最終到達線粒體細胞色素C氧化酶，其中，線粒體膜蛋白SCO1和COX11是COX17的靶蛋白，SCO1把COX17轉運的Cu+插入到細胞色素C氧化酶的CuA位點，同時，COX11把COX17轉運的Cu+插入細胞色素C氧化酶的CuB位點[18]。最新研究證明，除COX17之外，COX19和COX23也參與向線粒體轉運銅[19]；LYS7運送銅離子至銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD），Cu/Zn-SOD穿過線粒體外膜，把Cu+運到線粒體膜間隙[20]，整個吸收和轉運銅的過程見圖1。CUP1和CRS5是位于細胞質的金屬硫蛋白，它們能與Cu+相互作用，把多余的Cu+運到液泡中，以消除銅對細胞的毒害，對于液泡膜銅轉運蛋白的作用機理，現在尚不清楚[21]。

圖1 酵母銅轉運系統與轉錄調控示意圖[21]Fig.1 Copper transporter system and transcriptional regulation in Saccharomyces cerevisiae

近幾年來，關于釀酒酵母吸附去除重金屬的研究越來越多[22]。MRVCIC J等[7]研究發現，在靜置發酵條件下，經過8 h發酵，葡萄糖、蔗糖、糖漿培養基中的釀酒酵母Cu2+最大吸附量分別為1.16 mg/g、1.2 mg/g和0.81 mg/g，而固定搖床發酵條件，經過6 h發酵，葡萄糖、蔗糖、糖漿培養基中的Cu2+最大吸附量分別為0.98 mg/g、1.02 mg/g和0.7 mg/g，可見生長條件不同，釀酒酵母對Cu2+的吸附量也不同。釀酒酵母對Cu2+吸附的效果與pH有關，pH值為5.0～9.0時，可有效的去除重金屬Cu2+濃度0.5 mmol/L；pH為6.5發酵時，釀酒酵母對Cu2+的吸附量為0.7 μmol/mg[18]。可見酵母可以大量吸附Cu2+，而吸附量受發酵環境的影響。

1.2 銅對釀酒酵母生長活性的影響

銅是維持微生物正常生命活動所必需的微量元素，GIORGIO A J等[24]研究證明，在銅缺乏的培養基中，酵母的生長受到了嚴重的阻礙。Cu2+還會影響酵母對其他金屬的吸收，尤其是對鐵的吸收，進而影響酵母的生長，酵母對Fe2+的吸收，需要FET3的參與，而FET3的活性需要Cu2+作為其編碼的酶輔基[17]。低濃度的銅對酵母的生長有益，而高濃度的銅降低酵母的存活率，影響酵母的生長、數量、種類，碳、氮礦化以及群落的金屬抗性[25]。杜君等[26]研究證明了銅對酵母生活力的影響與銅濃度有關，他們發現，0.05 mmol/L Cu2+對釀酒酵母BH8、AWRI、Freddo的生長基本沒有影響，當Cu2+濃度達到1.0 mmol/L時，3株釀酒酵母的生長均受到了嚴重的抑制，并且，高銅逆境增加了酵母細胞呼吸缺陷型形成的頻率。AVERY S V等[27]證明，當Cu2+濃度在5 μmol/L時，釀酒酵母NCYC-1383的生長活力就降低了，而EKUNDAYO E O等[28]從來自尼日利亞貝寧城啤酒廠的啤酒渣中，篩選出的啤酒酵母BY2與BY4分別能耐受3.5 mmol/L和4.2 mmol/L的Cu2+濃度。可見，Cu2+對酵母的影響在酵母菌株之間存在很大的差異性。

2 銅對釀酒酵母發酵影響的研究

圖2 酒精生物合成途徑Fig.2 Ethanol biosynthesis pathway

由圖2可知，酒精發酵主要由酵母菌在厭氧條件下通過糖酵解（embden-meyerhof-parnas pathway）途徑，將葡萄糖降解為丙酮酸，然后在丙酮酸脫羧酶（pyruvate carboxylase）的作用下，將丙酮酸脫羧形成乙醛，乙醛在乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase）的作用下生成乙醇[29]。

過量的銅以離子形式進入發酵液時，可能會造成發酵的停滯或延遲[30-31]。有研究比較了Cu2+逆境對模擬葡萄汁培養基和真實釀酒葡萄汁培養基中酵母發酵行為的影響，結果發現，0.05 mmol/L Cu2+嚴重抑制了模擬葡萄汁的發酵過程，其產生CO2和酒精的量較對照組顯著降低，而殘糖量顯著增多；0.05 mmol/L Cu2+對赤霞珠葡萄汁發酵過程基本沒有影響。0.50 mmol/L Cu2+幾乎完全抑制了模擬葡萄汁的發酵過程，只是在一定程度上影響了赤霞珠葡萄汁發酵過程中CO2、酒精的產量以及對還原糖的利用率，但與對照組沒有顯著差異[32]。銅離子不僅影響發酵產物，還影響發酵副產物，FERREIRA J等[33]研究了Cu2+對VIN13、NT112、RJ11、D80、CC和NT50六株菌發酵力的影響和Cu2+對這六株菌發酵過程中的揮發酸生成量的影響。結果表明，在0.25 mmol/L Cu2+濃度條件下，菌株NT50、CC、D80的發酵力基本不受影響，而株菌VIN13、NT112和RJ11發酵完成后，發酵液中殘留了更多的葡萄糖和果糖，同時，六株菌發酵的揮發酸生成量均增加，其中，菌株RJ11和NT50的增加量最為顯著。Cu2+對酒精發酵的影響因菌株不同而異，有的菌株在Cu2+存在時發酵產生的酒精較對照減少[34]，而有的菌株酒精生成量卻較對照增加[35]。BRANDOLINI V等[36]研究了銅敏感型釀酒酵母SN9和抗銅型SN41，分別在添加32 mg/L和320 mg/L硫酸銅條件下的發酵過程。結果發現，銅敏感型菌株發酵活性在低Cu2+濃度條件下即受影響，高Cu2+濃度時，發酵完全被抑制，而抗銅菌株的發酵活力幾乎不受Cu2+影響，原因是抗銅酵母的細胞可以吸附大量的Cu2+，抗銅酵母細胞吸附Cu2+后是否影響發酵過程及產物還有待于進一步研究。

可見，Cu2+通過影響酵母活力，干擾其正常的生理代謝，進而影響整個發酵過程。同時，過量的Cu2+加速了葡萄酒中多酚類物質的氧化速率[37]，最終導致葡萄酒的品質下降。Cu2+對酵母發酵的影響在不同菌株之間以及不同發酵介質之間都存在顯著的差異性。對于銅離子如何影響酵母代謝的分子機制尚不清楚，有待于進一步的深入研究。

3 總結與展望

不合理使用銅制劑農藥會引起葡萄果實的銅污染，升高葡萄汁的銅含量，進而影響釀酒酵母正常的酒精發酵。Cu2+對酵母生長的影響在不同菌種之間存在差異性。Cu2+影響酵母酒精發酵在不同發酵介質之間也存在一定的差異性。當發酵液中的銅離子濃度過高時，會嚴重抑制酵母的生長和酒精發酵。而所查閱到的文獻研究都主要集中在Cu2+對酵母細胞活性以及發酵基本特性的影響，未見從分子層面揭示Cu2+影響酵母細胞代謝的機制；真實葡萄汁中的成分復雜，如一些具有生物活性的大分子物質（花色苷、類黃酮類），可能會對酵母細胞抗銅具有一定的作用，同時，篩選抗銅菌株或者通過分子技術改造酵母獲取抗銅酵母，這些方面都是值得進一步研究和探討的領域。

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Research advances in effect of Cu2+onSaccharomyces cerevisiaealcoholic fermentation

JIA Bo,ZHAN Jicheng,HUANG Weidong*
(College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Copper-based fungicides application has a long history,which can effectively control grape downy mildew,powdery mildew and other diseases,and it were used frequently and extensively in the vineyards around the world.Irrational use of copper-based fungicides can cause copper contamination on grapes.The increasing copper content in grape juice can affect the normal alcoholic fermentation ofSaccharomyces cerevisiae,and ultimately affect the quality of wine.The purpose of this paper is to provide a comprehensive overview on the effect of Cu2+on the viability and alcoholic fermentation ofS.cerevisiae,and to describe its future prospects of the former studies,aiming to provide a reference for deeper study of the effect of Cu2+onS.cerevisiae.

Cu2+;Saccharomyces cerevisiae;growth viability;alcoholic fermentation

Q939.97

A

0254-5071（2014）11-0006-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.002

2014-09-09

國家十二五科技支撐計劃（2012BAD31B07）；國家自然科學基金（31471835）；北京市科技計劃（D131100000513003）

賈博（1981-），男，博士，研究方向為葡萄酒微生物。

*通訊作者：黃衛東（1961-），男，碩士，教授，研究方向為酵母次生代謝生理和葡萄次生代謝與調控。