庫爾勒香梨采后貯藏期間“黑頭病”致病菌生物學特性的研究

楊焱，陳國剛

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

庫爾勒香梨采后貯藏期間“黑頭病”致病菌生物學特性的研究

楊焱，陳國剛*

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

庫爾勒香梨采后貯藏期間“黑頭病”致病菌菌絲生長最適溫度為28℃，最適pH值為7，在PDA培養基和梨汁培養基上有利于菌絲生長和產孢量。碳源、氮源對菌絲生長和產孢量的影響差異明顯，葡萄糖和蛋白胨為致病菌的最佳碳源和氮源。分生孢子對光比較敏感，完全光照有利于致病菌菌絲生長和分生孢子的產生量。55℃水浴處理10 min可致死致病菌的分生孢子，紫外輻照時間越長分生孢子的致死率越高。

庫爾勒香梨；生物學特性；分生孢子

新疆庫爾勒香梨是我國的名優特林產品之一。近年來，庫爾勒香梨出口國際市場，在國際市場占有的市場份額越來越大。現在對庫爾勒香梨的采后貯藏保鮮中出現新難題，萼部壞死當地果農稱為“黑頭病”。“黑頭病”是由多主枝孢菌（Cladosporium herbarumLink）引起[1]，黑頭病表現為果實萼端深綠色，且硬度較高，發病初期萼端果皮變黑色，若切開表皮，果肉有淺褐色蜂窩狀壞死現象，果肉略有苦味。發病后期黑頭部位稍有塌陷，萼端產生黑色霉層，病斑邊緣處果皮變為黑色，病斑與內部好果肉交界非常明顯，黑頭病部位呈蜂窩狀且有黏稠黑汁狀物質。國內外有些研究學者認為果蔬表皮易產生是黑斑病（black spot disease），也有研究學者稱它為頂腐病（blossom-endrot）。但作者認為黑頭病與黑斑病是有區別的，黑斑病只是表皮產生黑色或深褐色病斑，果肉完好，這與黑頭病的癥狀不一樣。WANG Y B等[2]研究了在鴨梨采收前，每年用外源水楊酸處理鴨梨5～10次，能有效防治鴨梨黑斑病的發生。日本岡山縣是日本有名的水果產地（包括葡萄、桃、梨等），自1989年以來NASU H[3]對桃的黑斑病研究表明，發病與開花后的20 d第一次出現，病果率不斷增加直到套袋，而樹枝上的病癥發病于五月中下旬遲于葉或果實發病。與本文中所研究的“黑頭病”的發病狀態有很大的不同。迄今為止關于本研究的病害報道甚少，因此，對庫爾勒香梨采后貯藏期間黑頭病致病菌生物學特性的進行研究，了解并確定致病菌的最適生長條件，可為黑頭病發病規律、病害防治及庫爾勒香梨長期貯藏提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多主枝孢菌（Cladosporium herbarumLink）：由病果分離、純化及進行鑒定得到。

試驗所用培養基配制參見《植物病害研究方法》[4]。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

胡蘿卜葡萄糖瓊脂培養基：胡蘿卜200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

水瓊脂（water agar，WA）培養基：20 g瓊脂，蒸餾水1 000 mL；

察氏培養基（Czapek’sagar）：葡萄糖30g，NaNO30.3g，K2HPO40.1 g，KCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，瓊脂1.8 g，蒸餾水1 000 mL。

梨果汁培養基[5]：將新鮮的庫爾勒香梨榨汁，取20 mL，將其總體積補足至100 mL，加入1.8 g瓊脂。

上述培養基pH自然，在115℃條件下濕熱滅菌20 min后備用[6]。

可溶性淀粉：天津市博奧化工有限公司；蔗糖：天津永晟精細化工有限公司；葡萄糖：天津盛奧化學試劑有限公司；乳糖：天津興復精細化工研究所；麥芽糖：上海藍季科技發展有限公司；甘露糖：上海藍季科技發展有限公司；甘油：天津致遠化學試劑有限公司；硝酸鈉：天津天達凈化材料精細化工廠；硝酸銨：成都市科龍化工試劑廠；硫酸銨：上海試劑四廠；氯化銨：天津百世化工有限公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；尿素：天津大茂化工試劑廠；酵母浸膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；NaOH：天津永晟精細化工有限公司；HCl：北京化工廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ZXSD-1160數顯不銹鋼電熱培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SPX-250B-Z生化培養箱：上海博迅醫療設備廠；SW-CJ-ICV超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術公司；MOTIC B SERIES生物顯微鏡：Motic有限公司等。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基對采后黑頭病致病菌菌絲生長量及產孢的影響[7]

無菌條件下在已活化的致病菌菌落邊緣取直徑為5 mm菌絲塊[8]，將菌絲塊分別接種于新鮮PDA、胡蘿卜葡萄糖瓊脂培養基、WA培養基、梨汁培養基、察氏培養基，在25℃條件下倒置培養。自第7天起每天測量菌落直徑（采用十字交叉法[9]）。10 d后用直徑5 mm的打孔器每個平板打取3個菌絲塊，于10 mL 0.1%的吐溫-80中，混合均勻，用血球計數板計數，測其產孢量。每種處理做3個平行。

1.3.2 碳源對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長量及產孢子量的影響[10-11]

以PDA培養基為基礎培養基，分別添加20.0 g可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、甘油，其他成分不變配制成不同碳源的培養基，以不加碳源的PDA培養基為對照。將菌菌絲塊接種在各培養基上，于25℃條件下培養。7 d和10 d后測菌落直徑并觀察產孢量。每種處理做3個平行。

1.3.3 氮源對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長量及產孢量的影響[12]

以察氏培養基為基礎培養基，分別添加3.00 g硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、尿素、酵母浸膏，其他成分不變配制成不同氮源的培養基，以不加氮源的察氏培養基作為對照。于25℃條件下培養。7 d和10 d后測菌落直徑并觀察產孢量。每種處理做3個平行。

1.3.4 溫度對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長量及產孢量的影響[13]

取菌絲塊，分別移至新鮮滅菌的PDA平板上。將其分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃的恒溫培養箱中倒置培養。7 d和10 d后測菌落直徑并觀察產孢量。每種處理做3個平行。

1.3.5 pH對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長量及產孢量的影響[14]

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調PDA培養基的pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，取菌餅分別接種在PDA培養基中央，于25℃條件下倒置培養。7 d和10 d后側菌落直徑并觀察產孢量。每種處理做3個平行。

1.3.6 光照對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長量及產孢量的影響[15-16]

取菌絲塊接種在新鮮PDA培養基中央（直徑100mm），光照條件設置為完全光照、12 h光照黑暗交替、完全黑暗，均在25℃條件下培養。7 d和10 d后測菌落直徑并觀察產孢量。每種處理做3個平行。

1.3.7 分生孢子致死溫度的測定

用無菌水配制孢子懸浮液分裝于已滅菌的試管中，水浴加熱，溫度升至預定值時開始計時，保溫10 min（預熱1 min）。溫度為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃[15]。吸取0.1 mL培養液到新鮮的PDA培養上涂布，25℃條件下倒置培養，每日觀察致病菌的菌落生長情況。每個處理做3個平行。

1.3.8 分生孢子抗紫外能力的測定[18]

配制孢子懸浮液，吸取0.1 mL孢子懸浮液接種于新鮮PDA培養基上，涂勻。在超凈工作臺中，分別用紫外線照射1 min、3 min、5 min、7 min、9 min，以不處理為對照。在25℃條件下培養8d，統計單菌落個數。每種處理做3個平行。分析致病菌對紫外線敏感性差異，致死率計算公式如下：

1.3.9 數據分析

采用SPSS17.0統計分析軟件進行處理，多重比較采用LSD和Duncan方法。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長及產孢的影響

不同培養基對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長及產孢的影響結果見表1。

表1 培養基對黑頭病致病菌菌絲生長及產孢的影響Table 1 Effect of different mediums on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表1可知，在試驗的5種培養基中，梨汁培養基上菌絲生長最快，培養7 d和10 d后菌落直徑分別為6.37 cm和8.20 cm，其次為PDA，在WA上生長最慢，培養10 d后僅為4.47 cm。在5種培養基上均可產生孢子，鑒于經濟考慮PDA為該致病菌培養的最佳培養基。

2.2 碳源對香梨采后致病菌的菌絲生長及產孢量的影響

碳源對香梨采后致病菌的菌絲生長及產孢量的影響結果見表2。

表2 碳源對致病菌菌絲生長及產孢量的影響Table 2 Effect of different carbon sources on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表2可知，致病菌在7種碳源上菌絲均可生長，其中葡萄糖、蔗糖、甘油、乳糖培養7 d和10 d后菌落直徑與其他碳源差異顯著或極顯著性，并且與對照差異極顯著。蔗糖、甘油、乳糖對菌絲生長無顯著差異；麥芽糖、甘露糖不利于菌絲生長。結果表明，葡萄糖有利于分生孢子的生長，并且與其他碳源差異極顯著，是該致病菌培養的最佳碳源。

2.3 氮源對香梨黑頭病致病菌菌絲生長及產孢量的影響

氮源對香梨采后致病菌的菌絲生長及產孢量的影響結果見表3。

由表3可知，培養7 d和10 d后，蛋白胨、酵母膏、氯化銨有利于菌絲生長，培養7 d后菌落直徑為6.07 cm、6.03 cm和5.83 cm，且三者差異不顯著（P＞0.05）；與對照差異極顯著。硝酸銨、硝酸鈉和尿素不利于致病菌菌絲生長與其他氮源及對照差異極顯著。蛋白胨有利于分生孢子的產生，并且與其他氮源及對照差異極顯著，是該致病菌培養的最佳氮源。

表3 氮源對致病菌菌絲生長及產孢量的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on mycelium growth and sprulation of the pathogen

2.4 溫度對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長及產孢量的影響

溫度對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長及產孢量的影響結果見表4。

表4 溫度對致病菌菌絲生長及產孢量的影響Table 4 Effect of different temperatures on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表4可知，5～35℃時致病菌均可以生長，20～30℃為致病菌適宜生長溫度，最適宜溫度為28℃。＞35℃或＜15℃致病菌菌絲生長較慢。10～35℃均可產生孢子，5℃和40℃未見有孢子產生；28℃有利于分生孢子的產生，且與其他溫度差異極顯著。

2.5 pH對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長及產孢量的影響

pH對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長及產孢量的影響結果見表5。

表5 pH對致病菌菌絲生長及產孢量的影響Table 5 Effect of different pH on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表5可知，致病菌菌絲在pH 3～11條件下均可以生長，適宜的pH值為5～8，最適宜的pH值為7，菌絲生長適宜環境為中性偏酸性。pH 3～11均有孢子產生，適宜產孢子環境的pH值為6，且與其他pH差異顯著。

2.6 光照對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長及產孢量的影響

光照對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長及產孢量的影響結果見表6。

表6 光照對致病菌菌絲生長及產孢量的影響Table 6 Effect of different light conditions on mycelium growth and sprulation of the pathogen

由表6可知，致病菌菌絲在完全光照、光暗12 h交替、完全黑暗條件下均可正常生長，培養10d后菌落直徑分別為8.07cm、7.63 cm和6.67 cm，完全光照與完全黑暗差異極顯著。因此，致病菌對光照較敏感。完全光照、光暗12 h交替和完全黑暗3個處理，均有孢子產生，完全光照有利于孢子的產生，更適合致病菌菌絲生長。

2.7 分生孢子的致死溫度

分生孢子在不同溫度處理條件下的孢子致死率結果見表7。

表7 不同溫度處理條件下分生孢子的萌發率Table 7 Spore germination rate of the pathogen treated at different temperature

由表7可知，首先在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃在恒溫水浴鍋中處理孢子懸浮液10 min后，然后在25℃恒溫培養24 h后，孢子萌發率分別為43.3%、32.67%、4.67%、0、0、0，并且相互之間差異極顯著。溫度升至≥55℃水浴10 min，分生孢子無一萌發。說明55℃在水浴中加熱10 min可致死致病菌孢子。

2.8 致病菌分生孢子抗紫外能力的測定

致病菌分生孢子抗紫外能力的試驗結果見表8。

表8 分生孢子的抗紫外能力Table 8 Anti-UV ability of conidium

由表8可知，紫外線輻照處理1min、3min、5min、7min、9 min后分生孢子致死率分別50%、80.67%、90%、91%、94%。輻照9 min分生孢子致死率最高，且與其他輻照時間差異極顯著。結果表明，輻照處理時間越長，分生孢子致死率越高，與李自芹等[18]研究結果一致。

3 結論

本試驗研究發現，環境對香梨采后黑頭病致病菌菌絲生長及產孢量有很大的影響。菌絲生長以PDA培養基最佳；菌絲生長最適溫度為28℃；最適pH值為7。完全光照的光照條件有利于菌絲生長及分生孢子的產生量。在所供試的碳源中，葡萄糖有利于致病菌菌絲生長及分生孢子的產生，供試氮源中蛋白胨最佳。55℃為致病菌分生孢子的致死溫度。紫外輻照9 min后致病菌的分生孢子致死率為94%。

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Biological characteristics of“black disease”pathogen duringPyrus bretschneideriRehd storage

YANG Yan,CHEN Guogang*
(College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

DuringPyrus bretschneideriRehd storage,the optimum mycelium growth of the“black disease”pathogen was at 28℃and pH 7.The PDA medium and pear juice medium were the most conducive to mycelium growth and sporulation.Effects of carbon and nitrogen sources on mycelium growth and sporulation were significant,and the optimal carbon source and nitrogen source were glucose and peptone,respectively.Conidium was sensitive to light,and full lighting was favorable for mycelium growth and sporulation.Pathogen conidium lethal condition was 55℃water bath for 10 min.The longer time of UV irradiation resulted in the higher lethal rate of conidium.

Pyrus bretschneideriRehd;biological characteristics;conidium

Q93-3

A

0254-5071（2014）11-0101-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.023

2014-10-12

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室開發基金（SKLF-KF-201208）；石河子大學高層次人才科研啟動（RCZX201222）

楊焱（1987-），女，碩士研究生，研究方向為果蔬貯藏與保鮮的科研工作。

*通訊作者：陳國剛（1977-），男，副教授，博士，研究方向為果蔬貯藏與保鮮科研工作及教學。