刺梨果渣發酵飼料蛋白的工藝研究

張瑜，李小鑫，羅昱，劉芳舒，丁筑紅

（貴州大學食品與釀酒工程學院，貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州省藥食同源植物資源研究開發中心，貴州貴陽550025）

刺梨果渣發酵飼料蛋白的工藝研究

張瑜，李小鑫，羅昱，劉芳舒，丁筑紅*

（貴州大學食品與釀酒工程學院，貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州省藥食同源植物資源研究開發中心，貴州貴陽550025）

以刺梨果渣為原料發酵生產飼料蛋白。研究以發酵產物中蛋白含量為指標，通過混合菌種進行發酵，篩選出最佳菌種比例，并通過單因素試驗和正交試驗得到混合菌發酵的最佳工藝條件。結果顯示，最佳菌種組合為白地霉/康寧木霉/熱帶假絲酵母（2∶1∶2），產物中蛋白質含量為14.87%；混合菌發酵的最佳工藝條件為尿素添加量2%，裝料量50 g/250 mL，料液比1∶1（g∶mL），接種量17%，發酵溫度30℃，發酵時間5 d。發酵產物中蛋白質含量較未發酵果渣提高了175.8%，游離氨基酸含量提高了56.3%，可溶性膳食纖維提高了37.34%，適口性得到改善，同時具有刺梨的特殊香味，適合作為飼料添加劑。

刺梨果渣；飼料蛋白；發酵工藝

貴州省刺梨資源十分豐富，鮮果蘊藏量約20～30萬t，在加工利用方面，大多數廠家以刺梨原汁為主，果實榨汁后產生的近50%的皮渣，直接作為飼料食用效果不佳，目前一般都是作為廢棄物處理或者簡單加工用于肥料部分添加，造成資源的極大浪費，而且果渣極易霉變發臭，對環境造成嚴重污染。

利用果蔬加工中廢棄的皮渣發酵生產飼料蛋白，國內外已經有很多研究和應用。殷月蘭等[1]利用綠色木霉（Trichoderma viride）、白地霉（Geotrichum candidum）、產朊假絲酵母（Candida utilis）和米曲霉（Aspergillus oryzae）進行混菌發酵三七渣，纖維素明顯降低，蛋白質含量提高，各類氨基酸的含量均衡，提高了三七渣的飼用價值。尹濤[2]利用蘋果渣為原料，采用固態好氧發酵，引入白腐真菌（Pleurotus ostreatus）和綠色木霉作為高效微生物菌群，并通過對發酵條件的控制，轉化為環境友好的有機肥料，使有機肥料肥分達到最高水平，對果渣進行了有效的利用。國外有利用芽孢桿菌（Bacillus subtilis）MA139固態發酵法制備飼料蛋白[3]，ILLANES A等[4]利用纖維素酶和突變株木霉對甜菜粕進行發酵制得飼料蛋白。而刺梨果渣發酵菌體蛋白飼料[5-8]這一方面研究很少。

通過參考其他果渣廢棄物研究的實踐基礎上，研究刺梨果渣的開發利用。刺梨果渣含有較多的糖、氨基酸、維生素C和黃酮類物質[9]，營養豐富，可以作為原料進行多種加工利用，開發出多種刺梨產品，不僅可以變廢為寶，還能保護環境，實現果渣資源的綜合利用，避免刺梨資源的浪費。開發研究飼料蛋白、膳食纖維和其他發酵產品，提高產品的附加值，減少浪費，為刺梨果渣的產業化開發提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果渣：刺梨由貴州省龍里縣提供，屬于貴農5號品種，將刺梨榨汁后留取果渣，用保鮮袋密封裝好，于4℃的冰箱中保存備用。

菌種：康寧木霉（Trichodermakoningii）GIM3.444、白地霉（Geotrichumcandidum）GIM2.69、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）GIM2.6：廣東省微生物菌種保藏中心。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，自來水1000mL，pH自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min。

麥芽汁瓊脂培養基：麥芽汁150 mL，瓊脂3 g，pH自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min。

耐高溫α-淀粉酶（2×104U/g）、中性蛋白酶（5×104U/g）、糖化酶（1×105U/g）：美國Sigma公司；無水乙醇（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；濃硫酸（分析純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：重慶川東化工有限公司；硫酸銅（分析純）：宜興市輝煌試劑有限公司；硼酸（分析純）：西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設備

101-3A電熱鼓風干燥箱、SPX-150B型生化培養箱：天津泰斯特儀器有限公司；KDN-04A凱氏定氮儀：浙江托普儀器有限公司；YXQ-LS-30SⅡ高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；T6新世紀紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；L-8800氨基酸自動分析儀：北京溫分分析儀器技術開發有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵：鄭州市世紀雙科實驗儀器有限公司；SX-2.5-10馬弗爐：南陽市鑫宇爐業有限公司；TGL-16G高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺梨果渣發酵飼料工藝路線

1.3.2 操作要點

采用新鮮的刺梨果渣，向刺梨果渣中加入一定量的尿素，與刺梨果渣混合均勻，制成固態培養基。白地霉/康寧木霉/熱帶假絲酵母混菌按照適當的比例接入固態培養基，在自然pH條件下，28℃培養箱中固態發酵培養4d。將發酵物在50℃條件下烘干至質量恒定，干燥物粉碎至60目備用。

1.3.3 種子液的制備[10]

一級種子試管培養：從斜面培養基上挑取一環，接種到在5 mL的液體培養基中，搖勻后，置于30℃培養箱中，培養24 h。

二級種子搖瓶培養：以5%的接種量將一級種子液接種到裝有60 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，置于30℃培養箱中，180 r/min，培養8 h。

種子液體擴大培養：以20%的接種量將二級種子液接種到裝有300mL液體培養基的1000mL三角瓶中，置于30℃培養箱中，180 r/min，培養8 h。

霉菌種子擴大培養[11]：從種子培養基上挑取一環，接種到斜面培養基上，28℃，培養72 h。用10 mL無菌水沖洗孢子，取1 mL接種到裝有60 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，在28℃，200 r/min，培養36 h。

1.3.4 發酵菌種的篩選

選擇合適的菌種及比例，在250 mL三角瓶中裝入50 g的果渣培養基，按照發酵工藝流程分別接入10%的種子液。在自然pH條件下，28℃培養箱中固態發酵培養4 d，將發酵后的產物在50℃條件下烘干至質量恒定，然后分析測定其蛋白含量。

1.3.5 發酵條件的研究

采用不同無機氮源、料液比、裝料量、接種量、發酵溫度及時間進行單因素試驗，在自然pH條件下，28℃培養箱中固態發酵培養4 d，在50℃條件下將發酵后的果渣烘干至質量恒定，測定其蛋白含量。在單因素試驗基礎上，選擇4因素3水平正交試驗設計優化發酵條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6 分析測定方法

灰分含量的測定：參照國標GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》中方法[12]；蛋白質含量的測定：分光光度法[13]；膳食纖維的測定：酶-重量法[14]；維生素C的測定：鉬藍比色法[15]；還原糖的測定：3，5-二硝基水楊酸法（dinitrosalicylic acid，DNS）[16]；游離氨基酸測定：氨基酸測定儀[17]；黃酮的測定：分光光度計法[18]。

2 結果與分析

2.1 混菌比例對發酵產物的影響

混菌發酵時，菌種之間可互相補償進行協同發酵，與單菌發酵相比能明顯提高蛋白質的含量[10]。在250 mL三角瓶中裝入50 g的果渣培養基，按照發酵工藝流程分別接入10%的混合種子液，分別采用不同比例白地霉/康寧木霉/熱帶假絲酵母混菌發酵，考察混菌比例對發酵產物中蛋白質含量的影響，結果見圖1。

圖1 不同混菌比例對蛋白質含量的影響Fig.1 Effect of different strains ratio on crude protein yield

由圖1可知，白地霉、康寧木霉和熱帶假絲酵母之間不同比例對發酵結果影響差別較大，當三者之間的比例為2∶1∶2時，產物中蛋白含量達到最高為14.87%，顯著性增加（P＜0.05）。白地霉和康寧木霉的接種比例太少會影響纖維素酶、淀粉酶等的分泌，導致果渣纖維素的降解效果差。但若霉菌接入比例過多，菌種之間的競爭作用大于協同作用也會影響發酵。因此，選擇白地霉/康寧木霉/熱帶假絲酵母的比例為2∶1∶2作為混合菌最佳配比。

2.2 發酵條件篩選結果

2.2.1 無機氮源對發酵產物中蛋白質含量的影響

向刺梨果渣培養基中分別添加的1%、2%、3%、4%、5%尿素，接入10%的混合菌種液體種子。在自然pH條件下，28℃培養箱中固態發酵培養4d，在50℃條件下將發酵后的果渣烘干至質量恒定，然后測定其蛋白質含量，結果見圖2。

圖2 尿素添加量對蛋白質含量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen addition on crude protein yield

微生物的生長需要利用無機氮源合成蛋白質，而刺梨果渣中含氮量少，無法滿足微生物的生長，需要加入無機氮源調節碳/氮（C/N）比例，更有利于提高蛋白質的含量。尿素廉價易得，成本低，故以尿素為氮源[20]。由圖2可知，果渣發酵后產物中蛋白質含量有明顯的提高，隨著尿素添加量的增加，發酵產物中蛋白質含量呈增長趨勢，尿素添加量＞2%后，蛋白質產量增加不明顯，超過3%時蛋白質含量下降。此外，尿素的分解需要尿素酶，殘留過多會影響品質，需要控制添加量[21]。綜合考慮，選擇2%為尿素的最佳添加量。

2.2.2 料液比對發酵產物中蛋白質含量的影響

每個250 mL三角瓶中添加50 g新鮮果渣，添加2%尿素，設置料液比分別為1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（g∶mL），接入10%的混合菌種液體種子。在自然pH條件下，28℃培養箱中固態發酵培養4 d，在50℃條件下將發酵后的果渣烘干至質量恒定，然后測定其蛋白質含量，結果見圖3。

圖3 料液比對蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of different material-water ratio on crude protein yield

在固體發酵過程中，培養基中水分含量對微生物的生長繁殖有很大的影響，因此微生物在發酵過程中須有其適宜的水分，才能保證發酵效果。霉菌和酵母需要的水分環境一般在65%左右[22]。由圖3可知，料液比為1∶1（g∶mL）時，蛋白質含量最高。含水量過高導致發酵基質多孔性降低，空氣減少，易引起發酵溫度過高，從而抑制了菌體的生長繁殖，反之含水量過低，培養基水分不充足，微生物生長受到抑制。由于果渣本身含有較多的水分，不需要加太多水，選擇料液比1∶1（g∶mL）為最佳。

2.2.3 裝料量對發酵產物中蛋白質含量的影響

設置裝料量分別為20 g/250 mL、30 g/250 mL、40 g/250 mL、50 g/250 mL、60 g/250 mL、70 g/250 mL、，料液比1∶1（g∶mL），添加2%尿素，接入10%的混合菌種種子液。在自然pH條件下，28℃培養箱中固態發酵培養4 d，在50℃條件下將發酵后的果渣烘干至質量恒定，然后測定其蛋白質含量，結果見圖4。

刺梨渣發酵中各菌種同時生長，屬于好氧兼性厭氧生長。因此，空氣的流通對微生物發酵有很大的影響，在提供微生物生長所需的氧氣的同時，還能帶走發酵產生的熱量和二氧化碳，提高發酵效率。由圖4可知，隨著裝料量的增加，蛋白質含量呈下降趨勢。裝料量在20～50 g/250 mL之間蛋白質含量變化不大，50 g/250 mL之后下降明顯，這是因為隨著裝料量增加，由于果渣堆積過厚，影響了空氣的流通，微生物的生長受到抑制?？紤]到發酵效果和經濟產能，選擇50 g/250 mL的裝料量較好。

圖4 不同裝料量對蛋白質含量的影響Fig.4 Effect of different liquid medium volume on crude protein yield

2.2.4 接種量對發酵產物中蛋白質含量的影響

每個250mL三角瓶中添加50g新鮮果渣，分別接入5%、10%、15%、20%、25%的混合菌種種子液，料液比1∶1（g∶mL），添加2%尿素。在自然pH條件下，28℃培養箱中固態發酵培養4 d，在50℃條件下將發酵后的果渣烘干至質量恒定，然后測定其蛋白質含量，結果見圖5。

圖5 不同接種量對蛋白質含量的影響Fig.5 Effect of different inoculum on crude protein yield

由圖5可知，隨著接種量的增加，菌種間的協同作用促進生長代謝，發酵產物中蛋白質含量也隨之增加，接種量為15%時，蛋白質含量最高。接種量過大，菌體繁殖過快、溫度升高，產生過多的代謝廢物，影響后期發酵，蛋白質含量反而有所下降；適宜的接種量，能夠有效地縮短發酵周期，提高發酵產物蛋白質含量?？紤]經濟的角度和生產實際需要，選擇接種量為15%。

2.2.5 溫度對發酵產物中蛋白質含量的影響

發酵溫度分別設置為24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，每個250mL三角瓶中添加50g新鮮果渣，料液比1∶1（g∶mL），添加2%尿素，接入15%的混合菌種種子液。在自然pH條件下，恒溫培養箱中固態發酵培養4 d，在50℃條件下將發酵后的果渣烘干至質量恒定，然后測定其蛋白質含量，結果見圖6。

圖6 發酵溫度對蛋白質含量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on crude protein yield

溫度是影響微生物生長的重要因素之一。溫度的改變常常影響微生物體內生化反應的速度，以及影響微生物的繁殖速度。由圖6可知，發酵溫度在30℃時微生物生長繁殖旺盛，蛋白質含量達到最高；而溫度過高，會使微生物體內蛋白質或核酸變性失活，菌體的生長受到抑制，產物中蛋白含量也隨之下降。因此，30℃為發酵的最適溫度。

2.2.6 發酵時間對蛋白質產物的影響

發酵時間水平分別設置為1d、2d、3d、4d、5d、6d，每個250mL三角瓶中添加50g新鮮果渣，按料液比1∶1（g∶mL），添加2%尿素，15%的混合菌種種子液。在自然pH條件下，28℃培養箱中固態發酵培養，在50℃條件下將發酵后的果渣烘干至質量恒定，然后測定其蛋白質含量，結果見圖7。

圖7 發酵時間對蛋白質含量的影響Fig.7 Effects of fermentation time on crude protein yield

由圖7可知，發酵初期，在1～3 d內，由于營養豐富，微生物快速的生長繁殖，產物中的蛋白質含量逐漸增加；到了發酵中期，在3～5d內，隨著培養基中糖類的消耗，同時木霉將果渣降解成糖類等物質，微生物生長進入一個相對平衡的階段，產品的粗蛋白基本保持恒定；發酵后期，5～7 d內隨著營養物質消耗殆盡，發酵副產物的增加，微生物無法繼續生長，蛋白質含量開始出現降低趨勢。發酵5d時，產物中蛋白質含量達到最大值，故選擇發酵時間為5d為最佳。

2.3 發酵條件優化正交試驗的結果

根據單因素的試驗結果，固定白地霉/康寧木霉/熱帶假絲酵母為2∶1∶2、尿素添加量2%及發酵時間5 d，選擇果渣的裝料量、發酵溫度、接種量和料液比進行L9（34）正交試驗，結果與分析見表2，正交試驗結果方差分析見表3。

表2 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3 正交試驗結果的方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影響試驗結果因素依次為A＞D＞C＞B，即裝液量＞料液比＞接種量＞發酵溫度，確定發酵條件最優水平組合為A3D2C3B2，即裝料量55 g/250 mL，料液比1∶1（g∶mL），接種量17%，發酵溫度30℃。在此最佳條件下進行驗證試驗，發酵產物中蛋白質含量為19.06%。

由表3可知，裝液量對蛋白質含量結果影響顯著（P＜0.05），料液比、接種量及發酵溫度對結果影響不顯著。2.4發酵后果渣成分分析

按照最優工藝條件及參數進行發酵培養，并對發酵后的產物進行測定，結果見表4。

由表4可知，發酵后產品中的蛋白質提高至19.06%，提高了171%，可溶性膳食纖維提高了37.34%，可溶性糖降低了93.77%，還原糖降低了66.5%，由于發酵過程中溫度和空氣的影響，維生素C損失較大，損失量84.13%。發酵后的果渣蛋白質明顯提高，不溶性纖維降低，營養成分得到重組，更適合做飼料添加劑。

表4 發酵前后刺梨果渣營養成分含量的比較Table 4 Comparision of nutritional ingredients in

對刺梨果渣中的游離氨基酸進行測定，共檢出15種氨基酸，其中精氨酸含量最高，為2.456 mg/g，其次為亮氨酸0.946 mg/g、賴氨酸0.961 mg/g。果渣發酵后，產物中游離氨基酸明顯增高，必需氨基酸含量豐富，可以作為一種理想的飼料蛋白。

3 結論

本試驗研究混合菌種對刺梨果渣的利用情況和固態發酵蛋白飼料的工藝條件，并對發酵前后營養成分的變化進行了研究。結果表明，以白地霉/康寧木霉/熱帶假絲酵母為2∶1∶2，接種量為17%，尿素添加量2%，裝料量55g/250mL，料液比1∶1（g∶mL），發酵溫度30℃，發酵時間5 d，得到的發酵產物中蛋白質含量為19.06%。

該試驗中采取固態發酵，成本低、投入少、操作簡單，可大量生產刺梨果渣，解決刺梨果渣腐爛造成的環境污染等問題，不僅豐富了刺梨果渣的利用途徑，還能在一定程度促進畜牧業的發展，為解決我國蛋白質飼料的短缺開辟一條渠道。

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Fermentation technology of feed protein withRoxburgh rosepomace

ZHANG Yu,LI Xiaoxin,LUO Yu,Liu Fangshu,DING Zhuhong*
(Guizhou Research and Development Center of Medicinal and Edible Plant Resources,Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province,College of Food and Wine Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Roxburgh rosepomace was used for the production of feed protein by fermentation.Using protein content in fermentation product as index, by the means of mixed strains fermentation,the optimal mixed strain ratio was screened.Then single factor test and orthogonal test was employed to get optimum process conditions of mixed starin fermentation.It turned out that the optimal compound strains wereGeotrichum candidum∶Trichoderma koningii∶Candida tropicalis2∶1∶2.Under this condition,the protein content was 14.87%.The optimal solid-state fermentation conditions were as follows:urea 2%,loading volume 50 g/250 ml,material-water ratio 1∶1(g∶ml),temperature 30℃,inoculum 17%,fermentation time 5 d.Under this condition,the protein content,free amino acids content and soluble dietary fiber increased 175.8%,56.3%and 21.06%,respectively.The product had better palatability with specialR.roseflavor,which was suitable for using as feed additives.

Roxburgh rosepomace;feed protein;fermentation processing

TS209

A

0254-5071（2014）11-0075-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.017

2014-07-17

貴州省科技廳區域合作項目（黔科合區域合[2013]7001號）；貴州省重大科技專項（黔科合重大專項字[2013]6006）；黔科合G字[2014]4003

張瑜（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

*通訊作者：丁筑紅（1966-），女，教授，本科，從事農產品加工教學科研工作。