兩個不同發(fā)酵時期豆瓣中微生物多樣性的差異對比

董丹，關統(tǒng)偉，趙輝平，車振明，張怡，鄭萍，張靜

（西華大學微生物研究所食品生物技術四川省高校重點實驗室，四川成都610039）

兩個不同發(fā)酵時期豆瓣中微生物多樣性的差異對比

董丹，關統(tǒng)偉*，趙輝平，車振明，張怡，鄭萍，張靜

（西華大學微生物研究所食品生物技術四川省高校重點實驗室，四川成都610039）

為了探明傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆瓣不同時期微生物的多樣性的差異對豆瓣風味品質(zhì)的影響，采用純培養(yǎng)的分離方法，對發(fā)酵中期（5個月）時期和成熟期（10個月）豆瓣進行了細菌16S rRNA和真菌18S rRNA的基因分析。結果表明，這兩個時期豆瓣中的微生物種類豐富，且差異很大。從發(fā)酵五個月的豆瓣中分離得到7個屬（Bacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Pichia、Candida、Wickerhamomyces），優(yōu)勢菌為Bacillus、Candida、Wickerhamomyces屬，分別占54%、11%、14%。成熟期中分離得到8個屬（Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Gracilibacillus、Pichia、Aspergillus屬），優(yōu)勢菌為Bacillus、Oceanobacillus、Halomona屬，分別占55%、16%、10%。

發(fā)酵豆瓣；微生物多樣性；系統(tǒng)發(fā)育分析

豆瓣是我國傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的典型代表，歷史悠久，為中華傳統(tǒng)生物食品產(chǎn)業(yè)之瑰寶。目前，豆瓣從傳統(tǒng)的烹飪調(diào)料發(fā)展到系列復合調(diào)味品銷售遍布全國，并出口美國、加拿大、新西蘭、日本等國家。

豆瓣是以優(yōu)質(zhì)的蠶豆和辣椒為主要原料，經(jīng)自然發(fā)酵而成的半流動黏稠體或半固態(tài)調(diào)味品。豆瓣自然發(fā)酵過程一般包括發(fā)酵制曲階段、發(fā)酵初期、發(fā)酵期3個階段，每個時期參與作用的微生物都存在一定的差異。在制曲階段，霉菌能夠分泌蛋白酶、肽酶、淀粉酶、糖化酶等多種酶，其中蛋白酶和肽酶將原料中蛋白質(zhì)分解成多肽及多種氨基酸；淀粉酶系把淀粉轉化成葡萄糖、雙糖、三糖等；這些氨基酸和糖類不僅是豆瓣風味的來源，而且為后階段其他微生物的生長創(chuàng)造條件。在發(fā)酵初期，酵母將糖發(fā)酵成酒精和二氧化碳，酒精既參與酯類的合成，又能被氧化成有機酸類，在豆瓣風味形成過程中發(fā)揮重要作用。自然發(fā)酵豆瓣醬醅中也存在一些對豆瓣品質(zhì)有不良影響的真菌，如毛霉和青霉能產(chǎn)生霉臭味，影響豆醬的風味；產(chǎn)毒黃曲霉和寄生曲霉還可產(chǎn)生黃曲霉毒素（Aflatoxins，AF）B1，其具有強烈的致癌、致畸和致突變作用，是食品安全重大隱患[1-5]。此外，細菌在豆瓣自然發(fā)酵中也發(fā)揮著重要的作用，在豆瓣發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生的有機酸與酵母產(chǎn)生的酒精形成酯類物質(zhì)，增添豆瓣的風味，同時還能抑制一些雜菌的生長[6]。學者們采用非培養(yǎng)和純培養(yǎng)技術探測了豆瓣中的微生物種群，但關于豆瓣發(fā)酵期間不同時期的微生物動態(tài)變化研究較少[7-10]。不同發(fā)酵周期豆瓣微生物發(fā)酵體系存在差異，種群組成特點，微生物種群類別，在不同自然發(fā)酵周期中的變化，種群的變化對發(fā)酵豆瓣的質(zhì)量和風味的影響等問題還沒有被完全闡述清晰。因此，針對不同發(fā)酵時期微生物的動態(tài)變化研究將對我國傳統(tǒng)寶貴技術資源的理解和規(guī)模化生產(chǎn)豆瓣工藝的提高以及風味多樣性的改善提供科學依據(jù)，這對于人工控制不同時期豆瓣發(fā)酵技術也將具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆瓣樣品：四川郫縣娟城豆瓣有限公司；Goldview、Tris堿、EDTA：上海生工生物工程有限公司；甘油、無水乙醇，異戊醇：都市科龍劑化工廠；Extaq DNA聚合酶、dNTP：大連Takara公司。

主要分離細菌培養(yǎng)基：高氏1號培養(yǎng)基（可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4）；LB培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[12]。

主要分離真菌培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基[11]、麥芽汁瓊脂（麥芽汁抽提物20g，蛋白胨1g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.7）、查氏培養(yǎng)基（蔗糖30 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.5 g，K2HPO41.0 g，NaNO33.0 g，水1 000 mL，pH 6.7）、薩氏培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，瓊脂20 g，麥芽糖40 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8）。

1.2 儀器與設備

S1000TM Thermal Cycle PCR儀：美國Bio-Rad公司；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化有限公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱、DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實驗儀器有限公司；PHS-3C酸度計：方舟科技有限公司；TB-214電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆瓣微生物分離

由于目前對豆瓣發(fā)酵過程中微生物組成的研究主要集中在制曲階段和發(fā)酵初期，因此本實驗選用發(fā)酵中期（5個月）與成熟期（10個月）的樣品作為研究對象，以彌補對發(fā)酵中后期研究的缺陷。

采用平板稀釋分離法篩選豆瓣中的細菌。稱取辣椒胚與甜瓣子的混合豆瓣樣品10 g，放入裝有90 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，加入無菌玻璃珠，120 r/min振蕩過夜，使樣品與水充分混合，得到10-1豆瓣懸浮液。依次制作10-2、10-3、10-4懸浮液。吸取0.1 mL 10-1、10-2、10-3、10-4豆瓣懸浮液分別涂布于分離培養(yǎng)基上，每個濃度設置三個重復并編號。分別在30℃、37℃倒置培養(yǎng)1～7 d后觀察菌落形態(tài)，進行菌落統(tǒng)計[13]。

1.3.2 微生物的純化

121℃高壓滅菌30 min，用無菌竹簽挑取分離培養(yǎng)基上的細菌單菌落，采用劃線法在純化培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。

1.3.3 豆瓣樣品中總DNA的提取

用無菌竹簽挑取綠豆大小，純化后的菌體于1.5 mL的離心管中，DNA的提取采用改良十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）[14-15]法。得到的樣品總DNA于-20℃保存，作為后續(xù)PCR的模板。

1.3.4 PCR及產(chǎn)物的純化

以提取得到的DNA為模板，細菌選擇通用引物Eμ27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；1490R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應條件：95℃、4 min；95℃、60 s，56℃、60 s，72℃、120 s，35個循環(huán)；72℃、10 min。真菌選擇引物ITS4（5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；ITS5（5'-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。反應條件：預變性95℃、4 min；循環(huán)94℃、30 s，退火53℃、30 s，延伸72℃、40 s，35個循環(huán)；延伸72℃、7 min。PCR反應體系為50 μL：10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 37.5 μL、DNA模板1 μL。PCR產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳時間40 min。

純化過程按照DNA膠回收試劑盒中的步驟進行，具體步驟參照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit試劑盒說明。

1.3.5 測序

PCR產(chǎn)物純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果提交NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLAST（basic local alignment search tool）序列分析。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵時期豆瓣樣品中微生物多樣性

2.1.1 發(fā)酵中期（5個月）的豆瓣微生物多樣性

從發(fā)酵中期豆瓣樣品中總共分離得到148株菌。通過形態(tài)學特征及生理實驗選出14株典型菌株，其測序比對結果如表1。

14株菌經(jīng)序列比對分屬于微生物的7個屬，即Bacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Pichia、Candida、Wickerhamomyces。148株菌中芽孢桿菌屬（Bacillus）有80株，占到總分離菌株的54%；Candida屬和Wickerhamomyces屬分別有17株和21株，占鑒定菌株的11%和14%，因此這3個屬可能是發(fā)酵5個月豆瓣樣品中的主要優(yōu)勢菌；另外4個屬（Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Pichia）相應微生物數(shù)量所占比例分別為7%、5%、5%、4%。

2.1.2 成熟期（10個月）豆瓣微生物多樣性

從成熟期豆瓣樣品中總共分離得到145株菌，通過形態(tài)學特征及生理實驗選出20株典型菌株，其測序比對結果如表2。

表1 發(fā)酵中期(5個月)樣品中微生物多樣性分析Table 1 Analysis of microbial diversity in the sample fermented for five months

表2 成熟期(10個月)樣品中微生物多樣性分析Table 2 Analysis of microbial diversity in the sample matured for ten months

20株菌經(jīng)序列比對分屬于微生物的8個屬，即Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Gracilibacillus、Pichia、Aspergillus。145株菌中芽孢桿菌屬（Bacillus）80株，海洋芽孢桿菌（Oceanobacillus）23株，嗜鹽單孢菌（Halomonas）14株，分別占總鑒定菌株的55%、16%、10%。這3個屬可能是成熟期豆瓣樣品中的主要優(yōu)勢菌；另外5個屬（Virgibacillus、Lactobacillus、Gracilibacillus、Pichia、Aspergillus）相應微生物數(shù)量所占比例分別為5%、5%、4%、4%、1%。

從表1和表2的結果可以看出，Bacillus屬作為絕對的優(yōu)勢菌存在于發(fā)酵中期和后期，這與芽孢桿菌具有極強的耐受性有直接的關系。芽孢桿菌具有一定的抑菌和發(fā)酵作用，同時能產(chǎn)生多種消化酶，如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等，可有效將豆瓣中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪分解為糖、氨基酸和醇類。在豆瓣發(fā)酵的數(shù)個月中，芽孢桿菌產(chǎn)生的各種酶類對豆瓣風味物質(zhì)的形成起著至關重要的作用。Candida和Wickerhamomyces兩種酵母出現(xiàn)在發(fā)酵5個月的豆瓣樣品中，作為發(fā)酵中期和后期的優(yōu)勢菌之一，酵母產(chǎn)生的酒精和乳酸產(chǎn)生的有機酸形成酯類物質(zhì)，增添豆瓣的風味，同時還能抑制一些雜菌的生長[16]。醬醅中糖含量高，pH適宜，酵母的酒精發(fā)酵旺盛，醬醅的酒精含量可超過2.0%，同時生成少量甘油、琥珀酸以及其他多元醇[17]，對于豆瓣風味物質(zhì)的形成十分重要。到發(fā)酵后期豆瓣中的理化性質(zhì)發(fā)生了變化，酵母的耐受性降低，不再作為優(yōu)勢菌存在，而海洋芽孢桿菌（Oceanobacillus）和嗜鹽單孢菌（Halomonas）成為除芽孢桿菌（Bacillus）外的優(yōu)勢菌，可能對豆瓣后期發(fā)酵起著重要作用。

2.2 不同發(fā)酵時期細菌和真菌組成差異分析

2.2.1 不同時期細菌的組成差異分析

選取兩個不同發(fā)酵時期典型細菌菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA4.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，所用方法為鄰接法，結果見圖1。

圖1 細菌16s rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA sequence

由圖1中2個時期豆瓣微生物系統(tǒng)發(fā)育分析可以看出，豆瓣發(fā)酵從發(fā)酵中期到成熟期（10個月）的過程中細菌的組成存在一定的差異。豆瓣樣品中總共分離得到的細菌有7個屬，即Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Gracilibacillus、Enterobacter。在豆瓣發(fā)酵中期的樣品中分離得到有5個屬，即Bacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Enterobacter屬，結合表1和表2可以得到，通過BLAST檢索發(fā)現(xiàn)這5個屬與其具有最高同源性菌株的相似性分別為99%、99%、98%、99%、100%。而成熟期新增Halomonas屬和Gracilibacillus屬，它們與具有最高同源性菌株的相似性都是99%。Bacillus、Oceanobacillus、Lactobacillus、Virgibacillus一直存在與發(fā)酵中期和發(fā)酵后期，可能為豆瓣發(fā)酵期的重要功能菌。

2.2.2 不同時期真菌的組成差異分析

選取兩個發(fā)酵時期分離得到的真菌序列，使用MEGA4.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。

圖2 真菌18S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of fungal 18S rRNA sequence

從圖2可以看出，從兩種豆瓣樣品中總共分離得到4個屬的真菌，即Pichia、Candida、Wickerhamomyces、Aspergillus，結合表1和表2可以得到，其與具有最高同源性菌株的相似性分別為99%、100%、99%、98%。Candida、Wickerhamomyces兩種酵母出現(xiàn)在發(fā)酵中期，在發(fā)酵后期沒有出現(xiàn)，說明在豆瓣發(fā)酵的中期豆瓣風物物質(zhì)的形成可能與這兩種酵母的發(fā)酵有著直接的關系，而到豆瓣發(fā)酵后期由于酵母耐受性降低，不再作為主要優(yōu)勢菌存在。此外，在成熟期仍然檢測到有曲霉（Aspergillus）的存在，這種曲霉很可能為添加發(fā)酵曲中遺留的菌株。

3 結論

本研究通過純培養(yǎng)的分離方法結合細菌16S rRNA和真菌的18S rRNA的基因分析對豆瓣發(fā)酵中期及后期的微生物組成進行了研究，分析了兩個時期微生物的組成差異，研究表明，豆瓣發(fā)酵過程中微生物的組成發(fā)生了一定程度的變化，細菌存在于整個發(fā)酵中期及后期，并處于優(yōu)勢地位，酵母多作為優(yōu)勢菌存在于發(fā)酵中期，發(fā)酵后期以細菌為主要優(yōu)勢菌。根據(jù)本實驗研究，豆瓣發(fā)酵中期與后期微生物群落發(fā)生了很大的變化且微生物的種類相當豐富，其中在發(fā)酵中期及后期以芽孢桿菌為主要的優(yōu)勢菌。除此之外，從實驗結果來看，嗜鹽單胞菌的比例也很高，這也可能是嗜鹽單胞菌能形成孢子潛伏在豆瓣發(fā)酵過程中，對于其存在是否對豆瓣發(fā)酵有一定影響還需要做進一步的研究。Candida和Wickerhamomyces兩種酵母是發(fā)酵中期主要的優(yōu)勢菌群。

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Differences in microbial diversity at two different fermentation stages of soybean paste

DONG Dan,GUAN Tongwei*,ZHAO Huiping,CHE Zhenming,ZHANG Yi,ZHENG Ping,ZHANG Jing
(Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province,Institute of Microbiology, Xihua University,Chengdu 610039,China)

In order to explore the effect of microbial diversity at the different fermentation stages on the soybean paste quality,the bacterial 16S rRNA and fungal 18S rRNA from the soybean paste samples fermented for five months and matured for 10 months were conducted by culture media method.The results showed that the both samples were rich in microbial diversity and had the difference.Isolates from the sample fermented for five months belonged to seven genus(Bacillus,Oceanobacillus,Virgibacillus,Lactobacillus,Pichia,Candida,Wickerhamomyces).The dominant microbes were Bacillus,Candida and Wickerhamomyces,and they accounted for 54%,11%and 14%,respectively.The isolates from the mature samples belonged to eight genus(Bacillus,Halomonas,Oceanobacillus,Virgibacillus,Lactobacillus,Gracilibacillus,Pichia,Aspergillus).The dominant microbes wereBacillus,OceanobacillusandHalomona,and they accounted for 55%,16%and 10%,respectively.

fermented soybean paste;microbial diversity;phylogenetic analysis

Q93-331

A

0254-5071（2014）11-0055-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.012

2014-10-08

教育部春暉計劃項目（No.13205639）；食品生物技術四川省高校重點實驗室項目（No.Szjj2013-045）；四川省教育廳基金項目（No.13205688）

董丹（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品加工。

*通訊作者：關統(tǒng)偉（1978-），男，副教授，博士，研究方向為微生物系統(tǒng)學與功能基因組學、食品微生物發(fā)酵工程。