蛇龍珠葡萄（煙臺產區）自然發酵醪中選育的釀酒酵母發酵特性研究

韓鵬，程仕偉，，姜文廣，趙慧，侯小芳，徐巖，李記明*

（1.煙臺張裕集團有限公司山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東煙臺265709；2.魯東大學生命科學學院，山東煙臺264025；3.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

蛇龍珠葡萄（煙臺產區）自然發酵醪中選育的釀酒酵母發酵特性研究

韓鵬1，程仕偉1，2，姜文廣1，趙慧2，侯小芳2，徐巖3，李記明1*

（1.煙臺張裕集團有限公司山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東煙臺265709；2.魯東大學生命科學學院，山東煙臺264025；3.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

對煙臺產區蛇龍珠葡萄自然發酵醪中篩選的12株釀酒酵母進行發酵特性研究。首先對發酵終止后的殘糖量和酒精體積分數測定，再對部分菌株進行耐酒精、耐酸、耐SO2和耐高糖能力測定，選取3株發酵性狀較好的釀酒酵母用于蛇龍珠干紅葡萄酒釀制。結果菌株YSF4的發酵特性良好，發酵后酒樣指標較好，甚至優于商品化酵母，具備工業葡萄酒釀造應用潛力。

蛇龍珠；自然發酵；釀酒酵母；發酵特性

蛇龍珠（Cabernet Gernischt）為解百納干紅釀造的主要原料之一，是我國特有的葡萄酒原料品種，也是我國第二大釀酒葡萄栽培品種（僅次于赤霞珠），已有超過110年的種植歷史[1-2]。蛇龍珠最初只在中國煙臺大規模種植，直至20世紀80年代末期才在全國范圍內推廣種植，目前煙臺產區的蛇龍珠釀酒葡萄栽培面積已接近6 667 hm2，約占全國的70%[3]。

微生物尤其是釀酒酵母是葡萄酒品質的決定性因素，采用不同釀酒酵母和相同葡萄原料發酵生產的葡萄酒，在色澤、香氣、感官質量以及出酒率等方面都存在較大的差異[4-7]。目前我國葡萄酒產業的一個突出問題是大量使用商品化活性干酵母導致葡萄酒品質同質化嚴重，擁有核心競爭力和地域特色的高品質葡萄酒品種偏少[8-11]。鑒于蛇龍珠葡萄是我國特有品種且在煙臺產地種植多年，其中必定蘊藏著豐富的本土釀酒資源。因此本研究的目的是通過多布點取樣并自然發酵，篩選能夠適應蛇龍珠葡萄酒釀造的高品質本土釀酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀造干紅的蛇龍珠原料：蓬萊大柳行葡萄種植基地；商品酵母D254和RC212：法國Laffort公司；酵母粉和蛋白胨：OXOID公司；其余試劑均為分析純或生物純。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；SWCJ-1B超凈工作臺：蘇州安泰；H1850R離心機：湖南湘儀實驗室儀器；WineScanTM葡萄酒分析儀：丹麥FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母的篩選

蛇龍珠釀酒葡萄破碎除梗后自然發酵3 d后，涂布孟加拉紅培養基（葡萄糖10g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，蛋白胨5g/L，孟加拉紅0.0133g/L，氯霉素0.1g/L，瓊脂20g/L，pH 6.5）。平板至長出單菌落，挑取單菌落轉接WL培養基平板（酵母粉4g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖50g/L，KH2PO40.55g/L，KCl 0.425 g/L，CaCl20.125 g/L，MgSO40.125 g/L，FeCl30.002 5 g/L，MnSO40.002 5 g/L，溴甲酚綠0.022 g/L，瓊脂20 g/L，pH 5.5），培養5 d后觀察菌落形態。

1.3.2 還原糖與酒精度測定

篩選的釀酒酵母首先經活化培養基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.5）活化20 h，接種環蘸取菌種入10 mL發酵培養基（葡萄糖220 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.5）試管中，以商品化酵母D254為對照，28℃恒溫培養，發酵6 d后測定還原糖和酒精度。采用DNS比色法測定還原糖的含量，重鉻酸鉀比色法測定酒精度[12]。

1.3.3 釀酒酵母耐受力測定

采用不同酒精體積分數（10%、13%、16%、19%）、檸檬酸質量濃度（5 g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L）、SO2質量濃度（60 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L）和葡糖糖質量濃度（200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L）的10 mL發酵培養基（內裝有杜氏管），接種已活化的菌液一環，以商品化酵母D254為對照，28℃恒溫培養48 h，依據杜氏管充滿CO2氣體時間來判定釀酒酵母的耐受力。

1.3.4 發酵生產干紅葡萄酒

菌種經活化培養基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.5）活化20 h后，在8℃、10 000 r/min條件下離心收集菌體，加無菌水混旋后離心洗滌2次，收集菌體備用。

成熟期的蛇龍珠釀酒葡萄經除梗破碎機粉碎，裝入20 L發酵瓶，裝液量15 L，按照10%的接種量接入釀酒酵母（活化培養基體積計），混勻后室溫條件下發酵，定期稱質量。發酵5 d后進入終止期，酒樣經5 000 r/min離心后利用葡萄酒分析儀測定酒精體積分數、總酸、揮發酸、殘糖，比色法測定單寧、色度、花色苷和總酚[13-15]。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母篩選

自張裕公司蓬萊、龍口和萊州種植基地分別采摘成熟期蛇龍珠釀酒葡萄，除梗破碎后分別裝入事先滅菌的1 L發酵瓶進行自然發酵，發酵3 d后取酒樣稀釋涂布孟加拉紅培養基平板，在28℃培養至長出單菌落，挑取酵母菌單菌落轉接WL顯色培養基，在28℃培養5 d。最終獲得具有明顯釀酒酵母特征的菌株12株，其在顯色培養基上的生長形態為奶油色且稍帶綠色、球形凸出、表面光滑、不透明，菌落形態見圖1（以菌株YSF8為例）。WL培養基對釀酒酵母的鑒別準確度可達100%[16]，結果可信度高，故篩選的菌株為釀酒酵母。

圖1 釀酒酵母YCF8在WL培養基上的生長形態Fig.1 Growth morphology ofS.scerevisiaeYCF8 in WL medium

2.2 產酒精能力與殘糖量分析

以商品化釀酒酵母D254作為對照，在發酵培養基中發酵6 d后的發酵液中殘糖量和酒精體積分數見表1。菌株YSF1、YSF2、YSF3、YSF4、YSF6、YSF8和YSF9的發酵后殘糖與酒精體積分數與D254的發酵后數據差異不大，故作為后續深入研究的酵母菌株，而菌株YSF5、YSF7、YSF10、YSF11和YSF12的發酵液中殘糖量均超過10g/L，酒精體積分數也相對較低。總體來看，發酵6d后的殘糖量未達到干酒的標準（≤4 g/L），原因可能是發酵培養基中氮源較豐富，與葡萄原料成分差異較大所致。

表1 發酵液中殘糖和酒精體積分數Table 1 Residual sugar and alcohol content in the broth

2.3 耐受酒精能力

釀酒酵母耐受酒精能力的結果見圖2。工業化葡萄酒釀造過程中酒精體積分數一般為12%[17]，在10%、13%、16%和19%酒精體積分數條件下，供試酵母均有較好的酒精耐受力，能夠滿足發酵要求。其中YSF2、YSF4和YSF8在不同酒精體積分數下的耐受能力與商品酵母D254相當，具備應用潛力，而菌株YSF1、YSF3、YSF6和YSF9的耐受力尤其是耐受高體積分數酒精能力略差。

圖2 釀酒酵母耐受酒精能力Fig.2 Alcohol tolerance ofS.cerevisiae

2.4 耐受SO2能力

釀酒酵母耐受SO2能力的結果見圖3。葡萄酒工業生產中SO2在葡萄汁中添加量為一般為60～100 mg/L[18]，由圖3可以看出，選育的釀酒酵母在60 mg/L、100 mg/L、150 mg/L和200 mg/L的SO2質量濃度條件下均能夠快速起酵，滿足葡萄酒釀造要求，其中YSF1、YSF2和YSF8的起酵速率優于商品化酵母。

圖3 釀酒酵母耐受SO2能力Fig.3 SO2tolerance ofS.cerevisiae

2.5 耐酸能力

圖4 釀酒酵母耐酸能力Fig.4 Acid tolerance ofS.cerevisiae

釀酒酵母的耐酸能力見圖4。由圖4可知，在檸檬酸質量濃度為5 g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L時，所用釀酒酵母均能夠正常發酵，滿足實際葡萄酒釀造要求。菌株YSF2、 YSF3、YSF4和YSF8的耐酸能力與商品酵母D254大致相當，而菌株YSF1、YSF6和YSF9對高質量濃度的有機酸的耐受力要低于D254。

2.6 耐高糖能力

供試菌株耐受高糖能力見圖5。由圖5可知，酵母菌YSF2、YSF3、YSF4和YSF8的耐受力與商品酵母D254無差異，而菌株YSF1、YSF6和YSF9對高質量濃度葡萄糖的耐受力要低于商品酵母D254。

圖5 釀酒酵母耐高糖能力Fig.5 High glucose tolerance ofS.cerevisiae

2.7 釀酒酵母發酵生產干紅葡萄酒

選取具有應用潛力的菌株YSF2、YSF4和YSF8進行發酵生產干紅葡萄酒試驗，以葡萄酒釀造生產中常用的商品酵母D254和RC212作為對照，發酵5d后測定各發酵參數指標，結果如表2所示。就酒精體積分數和總酸兩個指標而言，選育的3株酵母菌與商品化酵母無明顯差異，菌株YSF8的發酵酒樣中揮發酸含量較高，并且其殘糖為5.21 g/L，超過干紅葡萄酒4 g/L的標準。菌株YSF4的發酵酒樣中單寧和總酚含量是最高的，達到1 423.58 mg/L和1 140.44 mg/L，并且其花色苷含量和色度除略低于D254外，高于其余釀酒酵母的發酵酒樣。經品嘗，菌株YSF4的發酵酒樣香氣濃郁，有別于商品酵母的發酵酒樣。綜合以上研究結果，菌株YSF4具備工業化葡萄酒釀造潛力。

表2 發酵參數指標Table 2 Fermentation parameters of wine

3 結論

本試驗首先經酵母菌發酵培養后的殘糖量與酒精體積分數測定，篩選到7株發酵性狀良好的釀酒酵母。在對供試菌株的耐受酒精、耐SO2、耐酸和耐高糖能力的結果進行比較研究基礎上，篩選菌株YSF2、YSF4和YSF8用于發酵生產干紅葡萄酒，結果表明，YSF4菌株的發酵酒樣質量較好，部分指標優于商品化酵母，具備工業葡萄酒釀造應用潛力，后續香氣成分指標分析研究工作正在進行中。

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Fermentation characteristics ofSaccharomyce scerevisiaescreened by spontaneous fermentation with Cabernet Gernischt grapes(Yantai region)

HAN Peng1,CHENG Shiwei1,2,JIANG Wenguang1,ZHAO Hui2,HOU Xiaofang2,XU Yan3,LI Jiming1*
(1.Key Laboratory of Fermentation about Wine Microorganisms in Shandong Province,Changyu Group Company Co.,Ltd., Yantai 265709,China;2.School of Life Sciences,Ludong University,Yantai 264025,China; 3.Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The fermentation characteristics of 12 strains ofSaccharomyce scerevisiaescreened by spontaneous fermentation with Cabernet Gernischt grapes(Yantai region)were studied.Firstly,residual sugar content and alcohol content were determined after fermentation termination,and then the tolerance of alcohol,acid,SO2,and high glucose concentration were determined.At last,three strains that have better fermentation characters were used to produce dry red wine of Cabernet Gernischt.The results indicated that the strain YSF4 had good fermentation characteristics,and the wine samples had good index after fermentation,even superior to the commercialization yeast,which was suitable for industrial wine brewing industry.

Cabernet Gernischt;spontaneous fermentation;Saccharomyce scerevisiae;fermentation characteristics

TS201.3；Q938.2

A

0254-5071（2014）11-0037-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.008

2014-08-25

國家高技術研究發展計劃項目“863計劃”（2013AA102108-3）

韓鵬（1984-），男，工程師，碩士，研究方向為葡萄酒釀造。

*通訊作者：李記明（1966-），男，研究員，博士，研究方向為葡萄酒釀造。