傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉蛋白質(zhì)生物學(xué)變化與抗氧化能力研究

李雨楓，歐陽(yáng)晶，蘇悟，鄭小芬，蔣立文

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410128）

傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉蛋白質(zhì)生物學(xué)變化與抗氧化能力研究

李雨楓1，2，歐陽(yáng)晶1，2，蘇悟1，2，鄭小芬1，2，蔣立文2，3*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410128）

選取15種具有地區(qū)代表性的豆豉，測(cè)定總酸含量、水解度、水溶性蛋白含量、酸溶性蛋白含量、褐變指數(shù)及總抗氧化能力等指標(biāo)，利用描述性分析結(jié)合主成分分析、聚類分析對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，15種豆豉樣品在質(zhì)量指標(biāo)上差異性很大，其中中南地區(qū)樣品在指標(biāo)上優(yōu)于西南地區(qū)樣品；細(xì)菌型豆豉在酸溶性蛋白及水溶性蛋白含量上優(yōu)于霉菌型豆豉，干豆豉與濕豆豉在質(zhì)量指數(shù)上差別不大。主成分分析及聚類分析表明各質(zhì)量指標(biāo)與抗氧化性的關(guān)聯(lián)性從大到小依次為褐變指數(shù)＞總酸含量＞水解度＞水溶性蛋白含量＞酸溶性蛋白含量，干豆豉與細(xì)菌型豆豉在蛋白水解程度上要優(yōu)于其他豆豉，而后發(fā)酵時(shí)間是影響豆豉總抗氧化能力的主要因素。

豆豉；抗氧化肽；變異系數(shù)；聚類分析；主成份分析

豆豉是一種以黑豆或黃豆為原料利用微生物發(fā)酵制成的傳統(tǒng)調(diào)味品，以其風(fēng)味獨(dú)特、口感鮮香而深受人們的喜愛(ài)[1]。豆豉發(fā)酵過(guò)程中，微生物分泌蛋白酶將大豆中的蛋白質(zhì)酶解成為小分子蛋白、肽及氨基酸，不僅大幅提高了蛋白體外消化率[2]，同時(shí)賦予豆豉各種功能性特征[3-4]。

大豆抗氧化肽（soybean antioxidant peptide）是大豆蛋白水解產(chǎn)物中含有抗氧化功效的肽成分，是豆豉中含有的功能性成分之一[5]，其除了具備溶解度高、黏度低、穩(wěn)定性好[6]等優(yōu)點(diǎn)外。還具有良好的對(duì)抗自由基的能力[7]。我國(guó)是豆豉的發(fā)源地與主要的消費(fèi)國(guó)，但由于發(fā)酵中優(yōu)勢(shì)菌種、發(fā)酵工藝等因素各異，加之各地區(qū)自然條件、飲食習(xí)慣的不同，成就出各類不同品種的豆豉。如今對(duì)于大豆抗氧化肽制備方法的研究主要集中在可控酶解領(lǐng)域[8-9]及發(fā)酵領(lǐng)域[6]，而對(duì)于從發(fā)酵食品中提取的研究較少。調(diào)查不同地區(qū)豆豉的蛋白質(zhì)生物學(xué)變化與抗氧化能力有助于提升發(fā)酵大豆制品的營(yíng)養(yǎng)保健功能，為不同工藝豆豉之間保健特性的可能差異提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)選取15種具有地區(qū)代表性的豆豉，測(cè)定其總酸含量、水解度、水溶性蛋白含量、酸溶性蛋白含量、褐變指數(shù)及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）等指標(biāo)，采用描述性分析法、主成分分析法與聚類分析法進(jìn)行對(duì)比，篩選出各質(zhì)量指標(biāo)與總抗氧化能力最好的豆豉，以期為優(yōu)化豆豉生產(chǎn)工藝，提升發(fā)酵大豆制品營(yíng)養(yǎng)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從市場(chǎng)上采購(gòu)來(lái)自全國(guó)各地的15種豆豉樣品，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品均在保質(zhì)期內(nèi)，具體樣品名稱、產(chǎn)地等特性見(jiàn)表1。

表1 豆豉的基本情況介紹Table 1 Basic situation of Douchi

傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的生產(chǎn)地與消費(fèi)地主要集中在我國(guó)西南、華中、華南一帶，本試驗(yàn)選取豆豉包括優(yōu)勢(shì)菌種為細(xì)菌型3種、霉菌型12種；按區(qū)域劃分共有華中區(qū)4種、華南區(qū)2種、西南區(qū)7種、華北區(qū)1種、國(guó)外1種。因此本試驗(yàn)所采樣品在一定程度上可以代表傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉種類。

酚酞、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、四硼酸鈉、硼酸、甲基紅、溴甲酚紫、中性甲醛、磷酸二氫鉀、丙酮、三氯乙酸、乙醇，均為分析純：由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總抗氧化性（T-AOC）試劑盒：南京建成生物工程研究所；混合纖維素脂（水系）微孔濾膜（孔徑0.22 μm）：上海興亞凈化材料廠。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；7200可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼科儀器有限公司；GL-3250磁力攪拌器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司提供；KDN-103F自動(dòng)定氮儀：上海纖檢儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豆豉粗蛋白提取方法[11]

稱取25 g豆豉樣品，加入2.6倍質(zhì)量的丙酮，在冰水浴的條件下磁力攪拌30 min，放置在-18℃的冰箱中靜置1 h，然后4℃、10 000 r/min離心30 min，去除上清液，再次加入2.6倍質(zhì)量的丙酮、-18℃靜置1 h，離心，重復(fù)一次，得到的固體轉(zhuǎn)移至干燥托盤(pán)中，45℃干燥2 h去除丙酮，再經(jīng)冷凍干燥，得到豆豉粗蛋白。

1.3.2 分析檢測(cè)方法

樣品中總酸含量的測(cè)定采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中酸堿滴定法；氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定采用GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》按照甲醛值法；總氮含量的測(cè)定采用GB/T 5511—2008《谷物和豆類氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算凱氏法》中的凱氏定氮法。樣品水解度的計(jì)算公式如下：

樣品中褐變指數(shù)的測(cè)定[10]：依照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》對(duì)各豆豉原樣中的水分進(jìn)行測(cè)定，然后稱取2～3 g豆豉原樣，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，密封50℃振蕩1 h，定性濾紙過(guò)濾，濾液以1∶9比例稀釋，稀釋液在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定吸光度值，以水分含量為指標(biāo)換算成干基豆豉吸光度值。

粗蛋白中水溶性蛋白含量測(cè)定采用NYT 1205—2006《大豆水溶性蛋白含量的測(cè)定》中的凱氏定氮法進(jìn)行；粗蛋白中酸溶性蛋白含量測(cè)定采用GB/T 22492—2008《大豆肽粉》中的酸溶性蛋白測(cè)定方法進(jìn)行；粗蛋白中總抗氧化能力測(cè)定按照總抗氧化性（T-AOC）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析處理辦法

利用SPSS V19.0軟件，以15種豆豉各質(zhì)量指標(biāo)值為參數(shù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析、主成分分析與聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆豉質(zhì)量指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)定豆豉原樣中總酸含量、水解度、褐變指數(shù)與豆豉粗蛋白中水溶性蛋白、酸溶性蛋白、總抗氧化能力，結(jié)果如表2所示。

總酸含量直接影響了豉醅中各種酶的活性，并且不同酸度對(duì)微生物種類及發(fā)酵代謝也有影響[12]；發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)經(jīng)酶解暴露出親水基團(tuán)或解離成小分子水溶性物質(zhì)（肽、氨基酸等）均會(huì)造成蛋白水溶性、酸溶性與水解程度增加[13]，因此水解度、水溶性蛋白含量與酸溶性蛋白含量從一定程度上能代表豆豉中蛋白的解離程度；豆豉的褐變不僅由豆豉保溫后發(fā)酵階段羰基與氨基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的高分子類黑金物質(zhì)所造成，同時(shí)也與發(fā)酵體系內(nèi)一些低分子質(zhì)量有色化合物和類黑精物質(zhì)有關(guān)[14]，并且多肽與豆豉顏色的變化即黑色素的形成具有一定的聯(lián)系[15]。然而抗氧化肽的抗氧化性與產(chǎn)物中肽含量及其分子質(zhì)量大?。吹鞍椎乃獬潭龋┚哂忻黠@關(guān)聯(lián)性[9]，因此本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的各指標(biāo)均與抗氧化性具有一定的聯(lián)系。由表2可知，各豆豉質(zhì)量指標(biāo)數(shù)值較為離散，無(wú)法直觀分析樣品間差異，因此，將各豆豉質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行描敘性分析、主成分分析、聚類分析。

表2 豆豉原料的質(zhì)量指標(biāo)Table 2 Quality indexes of Douchi material

2.2 豆豉質(zhì)量指標(biāo)的變化

各種不同豆豉質(zhì)量指標(biāo)及變異系數(shù)見(jiàn)表3。

從表3可知，各類豆豉總酸含量均值為（20.34±7.54）g/kg、水解度為（20.54±9.87）%、褐變指數(shù)為（0.241±0.173）、水溶性蛋白含量為（18.75±5.49）g/100 g、酸溶性蛋白為（16.66± 4.96）g/100 g、總抗氧化能力為（1.801±0.737）U/mg；各類豆豉因產(chǎn)區(qū)、優(yōu)勢(shì)菌種與水分含量不同造成其品質(zhì)各異。從發(fā)酵中優(yōu)勢(shì)菌種上來(lái)看，霉菌型豆豉在總酸含量、褐變指數(shù)、總抗氧化能力方面要優(yōu)于細(xì)菌型豆豉，而細(xì)菌型豆豉的水溶性蛋白含量與酸溶性蛋白含量較高。相比霉菌型豆豉，細(xì)菌型豆豉發(fā)酵初期，諸如納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等細(xì)菌菌體增殖快[16]，代謝旺盛，產(chǎn)生了大量的蛋白酶，有助于水溶性蛋白與酸溶性蛋白的積累[17]；而霉菌型豆豉一般后發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，加之高鹽條件為耐鹽產(chǎn)酸微生物生長(zhǎng)營(yíng)造了良好的環(huán)境[18]，這可能是造成總酸含量較高的原因。并且長(zhǎng)時(shí)間的后發(fā)酵有利于類黑精等褐變物質(zhì)的累積[19]，使得褐變指數(shù)的增加。從豆豉水分含量上來(lái)看，兩類豆豉的質(zhì)量指數(shù)差別不大，濕豆豉在總酸含量、褐變指數(shù)與總抗氧化能力方面略高于干豆豉。干豆豉的制作一般于后發(fā)酵完成后進(jìn)行干制，控制了豆豉的水解程度，并且含水量較低不利于各類微生物的代謝及產(chǎn)生酶的作用[20]，這可能是干豆豉在總酸含量與褐變指數(shù)較濕豆豉低的原因。從產(chǎn)地上來(lái)看，中南地區(qū)豆豉在各質(zhì)量指標(biāo)上均比西南地區(qū)豆豉均值高，且中南地區(qū)豆豉變異系數(shù)較小，說(shuō)明其在質(zhì)量指標(biāo)上更為接近。中南地區(qū)豆豉均為霉菌發(fā)酵，且以濕豆豉為主，西南地區(qū)豆豉在優(yōu)勢(shì)菌種與干濕度上呈現(xiàn)多樣化，這些因素都有可能造成其質(zhì)量指標(biāo)上的差異。

表3 豆豉質(zhì)量指標(biāo)變幅及變異系數(shù)Table 3 Quality indicator variable amplitude and variable coefficient of Douchi

變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）是描述隨機(jī)變量的離散程度的指標(biāo)，能反映各種豆豉在同一指標(biāo)上的差異性[21]。從表3可知，總豆豉變異系數(shù)從大到小依次為褐變指數(shù)＞水解度＞總抗氧化能力＞總酸含量＞酸溶性蛋白含量＞水溶性蛋白含量；各指標(biāo)變異系數(shù)均＞10%，其中除水溶性蛋白含量與酸溶性蛋白含量外其他指標(biāo)變異系數(shù)均＞30%，褐變指數(shù)變異系數(shù)＞70%，這說(shuō)明各類豆豉在質(zhì)量指標(biāo)上有較大的差異性。

2.3 主成分的確定

以各類豆豉質(zhì)量指標(biāo)為變量，由表3的相關(guān)矩陣，通過(guò)使用主成分分析法計(jì)算該矩陣的特征值[22]，得到特征值和方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic values of principal component and contribution rates

由表4可知，就各主成分對(duì)豆豉質(zhì)量指標(biāo)變異的解釋，第一主成分能解釋所有豆豉質(zhì)量指標(biāo)變異的57.579%，第二主成分能解釋25.908%，且兩者特征值均＞1，總貢獻(xiàn)率＞80%。說(shuō)明兩個(gè)主成分已能夠客觀的反映各豆豉質(zhì)量指標(biāo)的變異，所以SPSS選擇兩個(gè)主成分：主成分1與主成分2。

圖1 聚類分析圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis

由圖1可知，所有的質(zhì)量指標(biāo)均在主成分1的正象限，水解度、水溶性蛋白含量與酸溶性蛋白含量遠(yuǎn)離坐標(biāo)中心，說(shuō)明主成分1主要以三者的影響即蛋白質(zhì)的解離程度影響為主；而總抗氧化能力、褐變指數(shù)、總酸位于主成分2的正象限，水解度、水溶性蛋白及酸溶性蛋白含量處于負(fù)象限，總抗氧化性遠(yuǎn)離坐標(biāo)中心，說(shuō)明其主要代表主成分2；載荷圖中各質(zhì)量指標(biāo)所示坐標(biāo)與總抗氧化性坐標(biāo)的直線距離代表了其與抗氧化性的關(guān)聯(lián)性，距離越短說(shuō)明關(guān)系越為接近。由圖1可知，各質(zhì)量指標(biāo)與抗氧化性的關(guān)聯(lián)性從大到小依次為褐變指數(shù)＞總酸＞水解度＞水溶性蛋白含量＞酸溶性蛋白含量。水解度、水溶性蛋白含量與酸溶性蛋白含量三者坐標(biāo)臨近，說(shuō)明它們有很強(qiáng)的聯(lián)系。

采用SPSS軟件對(duì)各豆豉質(zhì)量指標(biāo)與總抗氧化能力進(jìn)行聚類，采用歐氏距離和Ward的方法計(jì)算，可以得到聚類分析樹(shù)狀圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，所有的質(zhì)量指標(biāo)均在主成分1的正象限，水解度、水溶性蛋白含量與酸溶性蛋白含量遠(yuǎn)離坐標(biāo)中心，說(shuō)明主成分1主要以三者的影響即蛋白質(zhì)的解離程度影響為主；而總抗氧化能力、褐變指數(shù)、總酸位于主成分2的正象限，水解度、水溶性蛋白及酸溶性蛋白含量處于負(fù)象限，總抗氧化性遠(yuǎn)離坐標(biāo)中心，說(shuō)明其主要代表主成分2；按照三聚類（立方聚類標(biāo)準(zhǔn)，偽F和偽t2）法則，所有的最有分組數(shù)為3[23]，即為10時(shí)，分為組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。組分Ⅰ的豆豉均為來(lái)自中南部的霉菌型干豆豉，均為總抗氧化能力較高的品種；組分Ⅱ以濕豆豉為主；組分Ⅲ包含了大多數(shù)西南部的豆豉及細(xì)菌型豆豉。

圖2 主成分載荷圖Fig.2 Load diagram of principal components

利用SPSS對(duì)各豆豉質(zhì)量指標(biāo)與總抗氧化能力進(jìn)行主成分得分分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，主成分1解釋的主要是蛋白水解程度的變異，主成分1的正象限包括所有干豆豉與所有的細(xì)菌型豆豉種類。干豆豉蛋白水解程度高可能是干豆豉后發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)[24-25]，蛋白在酶的作用下得到充分的降解的結(jié)果。而細(xì)菌型豆豉水解程度高的原因可能是細(xì)菌相較霉菌在發(fā)酵初期菌體增殖快，代謝旺盛[16]，引起蛋白質(zhì)降解所造成的。主成分2解釋的主要是總抗氧化能力的變異，主成分2的負(fù)象限主要是水豆豉（10）、毛霉型水豆豉（1）、納豆（14）、臘八豆（2）等后發(fā)酵時(shí)間短的細(xì)菌霉菌性水豆豉，而正象限是諸如瀏陽(yáng)豆豉（12）、陽(yáng)江豆豉（6）等后發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)的霉菌型干豆豉，說(shuō)明后發(fā)酵時(shí)間可能與抗氧化肽的總抗氧化能力具有一定的相關(guān)性，長(zhǎng)的后發(fā)酵時(shí)間有利于豆豉體系中蛋白酶的充分利用，增加了多肽與寡肽的含量。WU H C等[26]報(bào)道蛋白水解產(chǎn)物抗氧化性與肽含量變化趨勢(shì)相同，這可能就是后發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)能增強(qiáng)豆豉抗氧化性的原因。綜合各豆豉的主成分得分，4號(hào)湖南風(fēng)味豆豉在主成分1得分與主成分2得分合計(jì)最高，說(shuō)明其具有良好的質(zhì)量指標(biāo)與抗氧化性。

圖3 主成分得分圖Fig.3 Score of principal components

3 結(jié)論

選取15種具有地區(qū)代表性的豆豉，測(cè)定總酸含量、水解度、水溶性蛋白含量、酸溶性蛋白含量、褐變指數(shù)及總抗氧化性（T-AOC）等指標(biāo)，利用描述性分析與變異系數(shù)分析得到15種豆豉樣品在質(zhì)量指標(biāo)上差異性很大，其中中南地區(qū)樣品優(yōu)于西南地區(qū)樣品；細(xì)菌型豆豉在酸溶性蛋白及水溶性蛋白含量上優(yōu)于霉菌型豆豉，干豆豉與濕豆豉在質(zhì)量指數(shù)上差別不大。

利用聚類分析得到三個(gè)組分。組分Ⅰ的豆豉均為來(lái)自中南部的霉菌型干豆豉，且均為總抗氧化能力較高的品種；組分Ⅱ以濕豆豉為主；組分Ⅲ包含了大多數(shù)西南部的豆豉及細(xì)菌型豆豉。說(shuō)明這些豆豉在一定的方面具有相似性。

利用主成分分析法對(duì)豆豉的各質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行分析，從載荷圖中可知，主成分1主要以水解度、水溶性蛋白及酸溶性蛋白含量的影響即蛋白質(zhì)的水解程度影響為主，主成分2主要以總抗氧化能力值的影響為主，各質(zhì)量指標(biāo)與抗氧化性的關(guān)聯(lián)性從大到小依次為褐變指數(shù)＞總酸＞水解度＞水溶性蛋白含量＞酸溶性蛋白含量；從主成分得分結(jié)果可知，干豆豉與細(xì)菌型豆豉在蛋白水解程度上要優(yōu)于其他豆豉，后發(fā)酵時(shí)間是影響豆豉在總抗氧化能力與褐變指數(shù)的主要因素。

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Protein biological changes and antioxidant capacity of traditional fermented Douchi

LI Yufeng1,2,OUYANG Jing1,2,SU Wu1,2,ZHENG Xiaofen1,2,JIANG Liwen2,3*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China; 3.Fermented Food Engineering and Technology Research Center of Hunan Province,Changsha 410128,China)

The 15 kinds of Douchi with regional representation were chosen in the test,to determine the total acid content,the hydrolysis degree,soluble protein content,acid soluble protein content,browning index,total antioxidant capacity and other indicators.The samples were evaluated by descriptive analysis combined with principal component analysis and cluster analysis.The results showed that there were the significant differences in quality indicators between each kind of Douchi samples.The samples from central south region were better than that from the southwest;in the aspect of the acid soluble protein and soluble protein content,bacteria-fermented Douchi was better than mold-fermented Douchi.There was no significant difference in quality between dry and wet Douchi.Principal component analysis and cluster analysis showed that the correlation in quality indicators and oxidation resistance in order was browning index,total acid content,hydrolysis degree,water-soluble protein content,acid soluble protein content.Referring to the protein hydrolysis degree,dry Douchi and bacteria-fermented Douchi were better than the other kinds,and post-fermentation time was the main factor affecting the total antioxidant capacity of Douchi.

Douchi;antioxidative peptide;variation coefficient;cluster analysis;principal component analysis

TS255.54

A

0254-5071（2014）11-0020-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.005

2014-09-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371828）

李雨楓（1993-），男，本科生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

*通訊作者：蔣立文（1968-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。