牙周炎發生時外周血中CD4+CD25+T細胞表達的變化研究

于西佼　杜毅　唐開亮

【摘要】 目的：探討CD4+CD25+Treg在牙周炎發生時的免疫調節作用。方法：選擇35只成年SPF級Wistar大鼠，絲線結扎加高糖飲食建立大鼠牙周炎發生的動物模型，獲得類似牙周炎自然病程的連續組織標本，病理切片確定病損，分別獲取第4、8、12、16周的大鼠外周血，術前未結扎組對照。以流式細胞儀檢測不同時段外周血中CD4+CD25+Treg的比例變化。結果：建立了Wistar大鼠牙周炎發生的動物模型，病理切片確定了牙周病損的存在。結果顯示伴隨牙周炎發生的牙槽骨的吸收逐漸增多。流式細胞儀結果顯示結扎后第4、8、12、16周外周血中CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的比例為7.70%、9.12%、9.74%、10.31%，與術前比較差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：外周血中CD4+CD25+Treg自牙周炎發生早期逐漸升高，牙周炎發生發展規律一致，從而證實CD4+CD25+Treg細胞參與介導了牙周炎發生的免疫調控。

【關鍵詞】 牙周炎發生； CD4+CD25+T細胞； 免疫調節

CD4+CD25+Treg的免疫調節作用已經成為免疫學研究的前沿課題，并取得了令人矚目的進展[1]。研究表明：CD4+CD25+Treg作為一個具有獨立功能的T細胞亞型，在維持免疫系統平衡過程中有著不可代替的作用[2]。在機體自我耐受、抗腫瘤、抗感染等重要免疫功能方面起著中心作用[3-4]。目前CD4+CD25+Treg在牙周炎發生時的免疫調節作用的研究仍較少。本研究動態觀察處于牙周炎發生不同時期的外周血中CD4+CD25+Treg的比例變化，探討CD4+CD25+Treg在牙周炎發生時的免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料 35只成年SPF級Wistar大鼠，體重300～350 g，雌雄各半，購于山東大學實驗動物中心。CD4-FITC抗體、CD25-PE抗體、PE-IgG1及FITC-IgG1同型對照抗體均購于美國eBioscience公司，流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 大鼠牙周炎模型的建立 氯胺酮腹腔注射（100 mg/kg）麻醉下，采用直徑為0.2 mm的正畸鋼絲分別從雙側下頜舌側穿過磨牙間隙，環繞第一磨牙牙頸部結扎。術后采用高糖飼料（蔗糖56 g、脫脂奶粉28 g、面粉6 g、酵母粉4 g、肝粉1 g、少量食鹽和新鮮蔬菜）和200 g/L高糖水進行喂養，術后4、8、12、16周，隨機抽取以上各7只，氯胺酮腹腔注射麻醉下肉眼觀察牙周組織變化，并做臨床檢查，探診出血及牙周袋探診，制作下頜磨牙牙體牙周標本。術前未結扎組7只為對照。

1.3 觀察指標 （1）齦溝出血指數（sulus bleeding index， SBI）：大鼠處死前，用探針輕探選用牙的牙周袋或齦溝10 s，不出血為0，出血為1。（2）探診深度（probing depth， PD）：大鼠處死后，用牙周探針探選用牙的牙周袋，每牙選近中頰、頰側、遠中頰3個點測量，取均值。（3）牙槽骨吸收值（alveolar bone loss， ABL）：大鼠處死取牙齦組織標本后，在4倍體視顯微鏡下測量從釉牙骨質界到牙槽骨嵴頂的長度，每牙選近中舌、舌側、遠中舌3個點測量，取均值。（4）組織學觀察：用新鮮配制的多聚甲醛溶液行心臟體外循環內灌注，多聚甲醛液固定，混合酸脫鈣梯度乙醇脫水，石蠟包埋，常規染色光鏡下觀察。

1.4 流式細胞儀檢測 每只大鼠心臟采血（約0.5 mL），儲存于EDTA抗凝管中，放置于4℃冰箱待測。加外周血50 μL至檢測管和對照管中；分別加入Anti-RatCD4-FITC 1 μL、Anti-RatCD25 Percp-eFluor710 0.5 μL和MouseIgG1kIsotype controlPercp-eFluor710 0.5 μL，混勻，室溫下暗處放置15 min；加0.5 mL新鮮準備的固定/破膜液，混勻，4 ℃冰箱放置45 min；加2 mL新鮮配制的1×破膜液，1800 r/min離心5 min，去上清，混勻；重復1次；加Anti-Mouse/RatFoxp3-PE和RatIgG2akIsotypecontrol-PE 5 μL，混勻，4 ℃冰箱放置30 min；加1 mL 1×破膜液1800 r/min離心5 min，洗滌1次；加0.5 mL1%多聚甲醛重懸，上流式細胞儀分析。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件包對各組數據進行統計學處理，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠牙周炎模型的建立 建立了Wistar大鼠牙周炎發生的動物模型；體視顯微鏡下觀察骨的吸收情況，測量從釉牙骨質界到牙槽骨嵴頂的長度，每牙選近中舌、舌側、遠中舌3個點測量，取均值，牙周炎發生的牙槽骨的吸收逐漸增多。見圖1。

圖1 牙槽骨吸收量

2.2 牙周炎發生不同時期CD4+CD25+調節性T細胞的表達變化 流式細胞儀結果顯示結扎后第4、8、12、16周，外周血中CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的比例為7.70%，9.12%，9.74%，10.31%，與術前比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 不同時期CD4+CD25+調節性T細胞的表達改變

3 討論

CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）作為調節性T細胞中最為重要的一群[5]。天然的CD4+CD25+T細胞主要來源于胸腺，這部分稱為固有性CD4+CD25+T細胞，其產生于胸腺，然后遷移到外周發揮作用，CD4+CD25+Treg胸腺細胞與外周的CD4+CD25+Treg一樣，表現對經由TCR的抗原刺激呈低反應性，并且顯示抑制其他T細胞增殖的能力。這些在胸腺發育成熟后進人外周淋巴組織CD4+CD25+Treg，主要在預防病理性自身免疫反應方面起作用[6]。在外周，有抗原刺激（如TGF-β）或免疫抑制因子（如IL-10）誘導的條件下，成熟T細胞也可分化CD4+CD25+Treg，這部分稱適應性CD4+CD25+Treg主要在微生物感染和移植免疫中起作用。endprint

CD4+CD25+Treg在許多感染性疾病，尤其是在慢性持續感染中均存在免疫抑制作用[7-8]。這種免疫抑制作用有利于病原體存活，但同時也避免了機體過度免疫應答所產生的病理損害。RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其發病機制尚不清楚。近年來人們發現CD4+CD25+Treg與RA密切相關。與正常小鼠相比，通過注射抗CD25的單抗去CD4+CD25+Treg的小鼠膠原性關節炎更重，抗Ⅱ型膠原抗體的濃度更高。主動轉移CD4+CD25+Treg細胞后，可以明顯減緩疾病進展，明顯降低關節炎的嚴重程度，而且主動轉移后不久即可在炎癥性滑膜處發CD4+CD25+Treg，從而說明調節作用在關節局部發生[9]。本研究結果表明，伴隨大鼠牙周炎病損的確立外周血中CD4+CD25+Treg比例逐漸升高，機體通過調節CD4+CD25+Treg控制炎癥免疫的發生。

參考文獻

[1] Lee J， Choi Y S， Shin E C， et al. Ribavirin does not impair the suppressive activity of foxp3+CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Immune Netw， 2013， 13（1）：25-29.

[2] Chatila T A. Role of regulatory T cells in human diseases[J].J Allergy Clin Immunol， 2005， 116（5）：949-959.

[3] Kim H R， Lee S M， Won J W， et al. Functional changes in regulatory T cells during an experimental infection with sparganum （plerocercofid of Spirometra mansoni）[J].Immunology， 2013， 138（1）：57-67.

[4] Chen X， Du Y， Huang Z. CD4+CD25+ Treg derived from hepatocellular carcinoma mice inhibits tumor immunity[J]. Immunol Lett， 2012， 148（1）：83-89.

[5] Tsurikisawa N， Saito H， Oshikata C， et al. Decreases in the numbers of peripheral blood regulatory T cells， and increases in the levels of memory and activated B cells， in patients with active eosinophilic granulomatosis and polyangiitis[J].J Clin Immunol， 2013， 33（5）：965-976.

[6]姜玲，程光敏，姜淑慧，等.正常妊娠外周血CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞和雌二醇水平變化的研究[J].中國醫學創新，2011， 8（19）：31-32.

[7]唐瑛，崔為發，劉永，等.急性白血病患者外周血中CD4+CD25+ Foxp3+Treg細胞的表達及臨床意義[J].中外醫學研究， 2012， 10（7）：17-18.

[8]劉凱山.CD4_CD25_調節性T細胞及其臨床應用[J].實用醫學雜志， 2010， 26 （11）：2049-2051.

[9]李曉娟， 胡義平， 劉雋永.CD4_CD25_Foxp3_調節性T細胞和類風濕關節炎的治療[J]. 現代免疫學， 2009， 29（6）：514-519.

（收稿日期：2013-07-29） （本文編輯：黃新珍）endprint

CD4+CD25+Treg在許多感染性疾病，尤其是在慢性持續感染中均存在免疫抑制作用[7-8]。這種免疫抑制作用有利于病原體存活，但同時也避免了機體過度免疫應答所產生的病理損害。RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其發病機制尚不清楚。近年來人們發現CD4+CD25+Treg與RA密切相關。與正常小鼠相比，通過注射抗CD25的單抗去CD4+CD25+Treg的小鼠膠原性關節炎更重，抗Ⅱ型膠原抗體的濃度更高。主動轉移CD4+CD25+Treg細胞后，可以明顯減緩疾病進展，明顯降低關節炎的嚴重程度，而且主動轉移后不久即可在炎癥性滑膜處發CD4+CD25+Treg，從而說明調節作用在關節局部發生[9]。本研究結果表明，伴隨大鼠牙周炎病損的確立外周血中CD4+CD25+Treg比例逐漸升高，機體通過調節CD4+CD25+Treg控制炎癥免疫的發生。

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（收稿日期：2013-07-29） （本文編輯：黃新珍）endprint

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（收稿日期：2013-07-29） （本文編輯：黃新珍）endprint