支氣管哮喘患兒痰液Eos比例、MMP-9水平變化及意義

鄧?yán)蚶?，?驍，彭艷輝

(1郴州市第一人民醫(yī)院北院，湖南郴州423000;2郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院; 3南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

支氣管哮喘是一種氣道炎癥性疾病，炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病中的作用是近年哮喘病研究的熱點(diǎn)。2010年10月～2011年10月，我們對(duì)40例支氣管哮喘患兒痰液嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)比例、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)進(jìn)行了測(cè)定，旨在探討支氣管哮喘患兒不同病程誘導(dǎo)痰液中上述指標(biāo)的變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院收治的輕度支氣管哮喘患兒40例(觀察組)，男20例，女20例;年齡6～10歲。均符合兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。排除標(biāo)準(zhǔn):①除哮喘之外的喘息性疾病及其他呼吸系統(tǒng)相關(guān)性疾病(如支氣管肺發(fā)育不良、支氣管異物、胃食管返流等);②合并嚴(yán)重心肝腎等內(nèi)臟疾病、免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、傳染性疾病、寄生蟲疾病、皮膚病;③發(fā)病前2個(gè)月內(nèi)曾經(jīng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及非糖皮質(zhì)激素類抗炎藥如色甘酸鈉、白三烯調(diào)節(jié)劑、抗組胺抗過敏藥物等;④不能耐受高滲鹽水霧化或經(jīng)高滲鹽水霧化30 min后仍無痰的小兒或重度喘息發(fā)作者。另選同期健康體檢兒童40例(對(duì)照組)，男21例，女19例;年齡5～9歲。兩組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 痰液Eos計(jì)數(shù)及MMP-9檢測(cè)方法

1.2.1 痰液誘導(dǎo) 參照歐洲呼吸協(xié)會(huì)誘導(dǎo)痰液指導(dǎo)小組的指南［2］并加以改進(jìn)。對(duì)照組、觀察組急性期(入院24 h內(nèi))及臨床緩解期(臨床癥狀停止及哮鳴音消失后5 d)進(jìn)行誘導(dǎo)痰，具體方法如下:受試者清潔口鼻后吸入200μg沙丁胺醇，用醫(yī)用面罩式超聲霧化器，直接吸入 3%高滲鹽水，流量為1 L/min，誘導(dǎo)20～30 min，誘導(dǎo)過程中隨時(shí)將痰咳出，不易咳出者則由專職護(hù)師按正規(guī)操作吸痰，將痰置于干凈、無菌的帶刻度容器中。同時(shí)嚴(yán)密觀察小兒的呼吸頻率、氣喘等情況，如不能耐受或吸入高滲鹽水后30 min仍無痰液導(dǎo)出則立即停止操作。收集的痰液在1 h內(nèi)處理，處理前4℃冰箱保存。

1.2.2 痰液處理 ①選取合格痰液。挑取含黏液的痰栓，顯微鏡下觀察鱗狀上皮細(xì)胞小于5%并可見肺巨噬細(xì)胞時(shí)認(rèn)為是合格［3］。②將痰液稱重，加入4倍痰量0.1%的二硫蘇糖醇，在旋渦式混合器上混勻。③置于37℃恒溫水育箱孵育15 min。④加4倍痰量磷酸鹽緩沖液(PBS)后繼續(xù)水浴5 min。⑤將稀化的痰液經(jīng)48μm尼龍膜過濾后，離心機(jī)2 000 r/min離心10 min，收集上清液，-70℃冰箱保存待測(cè);細(xì)胞成分重懸于PBS中，涂片2張，編號(hào)。

1.2.3 痰細(xì)胞染色 將涂片自然干燥后置于二甲苯內(nèi)2 min。再移至無水乙醇內(nèi)2 min，取出排液后移至90%乙醇內(nèi)1 min。再移至蘇木素染液內(nèi)靜置30 min，然后置入沖洗盆內(nèi)沖洗10 min，使粉紅色變?yōu)樗{(lán)色。涂片在鹽酸乙醇內(nèi)浸漬伴搖動(dòng)數(shù)秒，再次沖洗使涂片再次變藍(lán)。將涂片移到1%伊紅液內(nèi)2 min，對(duì)比染色，再?zèng)_洗涂片3 min，分化伊紅。取出排液后移到90%乙醇內(nèi)搖振15 s，再移至無水乙醇Ⅰ內(nèi)搖振15 s，再移至無水乙醇Ⅱ內(nèi)搖振30 s。涂片移至二甲苯Ⅰ內(nèi)15 s，再移至二甲苯Ⅱ內(nèi)15 s，取出后封固。

1.2.4 Eos計(jì)數(shù) 由不知道患者病情的病理醫(yī)師在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)400個(gè)有核細(xì)胞(包括Eos、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)，計(jì)算Eos比例。

1.2.5 MMP-9檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)兩組痰上清液MMP-9。試劑盒由美國R＆D Systems公司提供，嚴(yán)格按說明書步驟操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。所得數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較則采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩變量之間相關(guān)性檢驗(yàn)則采用直線相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組痰液中Eos比例、MMP-9水平比較，見表1。觀察組急性發(fā)作期、臨床緩解期MMP-9水平與Eos比例均呈正相關(guān)(r分別為0.89、0.92，P均＜0.01)。

表1 兩組痰液中Eos比例、MMP-9水平比較(±s)

表1 兩組痰液中Eos比例、MMP-9水平比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與同組臨床緩解期比較，△P＜0.01

組別 Eos(%) MMP-9(ng/mL)觀察組急性發(fā)作期 15.50±0.28＊△ 132.25±0.85＊△臨床緩解期 10.78±0.25* 101.80±5.32*對(duì)照組0.48±0.54 41.04±0.45

3 討論

支氣管哮喘是氣道炎癥性疾病，急性炎癥引起支氣管平滑肌收縮、血漿滲出等，從而導(dǎo)致喘息急性發(fā)作。支氣管哮喘也是慢性氣道炎癥，即在無癥狀的穩(wěn)定期氣道炎癥仍存在，以致喘息反復(fù)發(fā)作和氣道重塑。反復(fù)炎癥刺激可引起氣道重塑，其表現(xiàn)為氣道壁增厚、氣道平滑肌增生肥大及氣道壁細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)各成分的改變。誘導(dǎo)痰是以高滲鹽水霧化吸入誘導(dǎo)無痰或少痰受檢者產(chǎn)生足量痰液，以對(duì)下氣道分泌物中的細(xì)胞及其他液相成分進(jìn)行分析研究的一種無創(chuàng)的檢測(cè)方法。作為一種直接的非侵入性定量定性檢測(cè)氣道炎癥的方法［4］，誘導(dǎo)痰安全、可靠［5］、簡(jiǎn)便且患者易于接受，其具體優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)如下:①標(biāo)本來源豐富，易濃縮和重復(fù)，且安全性高;②可提供與支氣管肺泡灌洗液相似的氣道炎癥的定量信息;③可直接檢出與炎癥反應(yīng)相關(guān)的炎性細(xì)胞、炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子;④誘導(dǎo)痰液來源于外周氣道至中央氣道比來源于肺段氣道和肺泡的分泌物，更能反映氣道分泌物的自然狀態(tài)。

痰液細(xì)胞成分可進(jìn)行細(xì)胞分類、免疫組化和分子生物學(xué)等檢查，而液相成分可用于分子成分的測(cè)定，因此可對(duì)哮喘患兒的痰液細(xì)胞成分進(jìn)行分析，以研究氣道炎癥發(fā)生的可能機(jī)制。Gereng等［6］發(fā)現(xiàn)，哮喘患者誘導(dǎo)痰中Eos的形態(tài)和功能與血液檢測(cè)結(jié)果一致，Eos是臨床上反映氣道炎癥的重要標(biāo)志。本研究顯示，觀察組急性發(fā)作期Eos比例明顯高于臨床緩解期及對(duì)照組，說明Eos參與哮喘的發(fā)病，這與Louis等［7］研究結(jié)果一致;本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組臨床緩解期Eos比例亦高于對(duì)照組，提示喘息停止后氣道炎癥和氣道高反應(yīng)仍可以長期存在。因此，本研究為哮喘病長期規(guī)范治療的必要性提供了一定的理論基礎(chǔ)，即哮喘病診斷一旦成立，不論輕重，都需要進(jìn)行及時(shí)且持續(xù)地抗炎治療。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族是由20多種高度保守的鋅、鈣離子依賴性蛋白內(nèi)切酶所組成，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白。在MMPs中，MMP-9與哮喘的關(guān)系最密切［8，9］。MMP-9的增加，可導(dǎo)致氣道損傷，促進(jìn)炎性細(xì)胞到達(dá)間質(zhì)和氣道壁，刺激、激活基質(zhì)的生長因子，促進(jìn)血管生成、成纖維細(xì)胞增生和分解呼吸道和肺內(nèi)的結(jié)構(gòu)復(fù)合物ECM和基底膜，因此參與呼吸道和肺的重建［10，11］。本研究顯示，觀察組急性發(fā)作期MMP-9水平明顯高于臨床緩解期及對(duì)照組，可知MMP-9水平升高是反映喘息急性發(fā)作及氣道炎癥變化較為客觀的指標(biāo)，此與Belleguic等［12］研究一致;本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組臨床緩解期MMP-9水平亦高于對(duì)照組，說明MMP-9作為氣道炎癥標(biāo)志物，與喘息發(fā)作頻率和發(fā)作的時(shí)間長短有關(guān)。同時(shí)亦提示不管是喘息正在發(fā)作，還是喘息停止，氣道炎癥依然持續(xù)存在。

在炎癥狀態(tài)下，炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞表達(dá)MMP-9明顯增強(qiáng)［13］。MMP-9降解時(shí)，其在內(nèi)皮和上皮細(xì)胞基底膜上打孔，從而促使炎性細(xì)胞游出和聚集于靶器官。降解的片斷具有趨化作用，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的加重;氣道的炎癥可以引起氣道的損傷，進(jìn)而引起氣道的修復(fù)和重塑。本結(jié)果顯示，觀察組急性發(fā)作期、臨床緩解期MMP-9水平與Eos比例均呈正相關(guān)，說明兩者共同參與了喘息發(fā)作的病理生理過程。ECM重建是哮喘發(fā)病的重要特征，在TNF-α刺激下，其主要效應(yīng)細(xì)胞Eos的MMP-9轉(zhuǎn)錄水平顯著增高。該現(xiàn)象可被NF-κB抑制劑和蛋白激酶C抑制因子所抑制，說明Eos受到炎性介質(zhì)刺激后可大量合成MMP-9，參與氣道的改建。同時(shí)活化的MMP-9又促進(jìn)Eos穿越基底膜向炎性反應(yīng)部位浸潤，從而形成惡性循環(huán)。但MMP-9水平與Eos比例不是完全相關(guān)，這一點(diǎn)也提示氣道炎癥的改變并非僅由氣道局部浸潤的Eos決定，也許還存在其他因素的參與，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

總之，誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞尤其是Eos及細(xì)胞因子MMP-9與哮喘患兒氣道病變的關(guān)系密切，兩者能較好反映哮喘氣道炎癥狀況，其有望成為無創(chuàng)觀察哮喘病情變化的新指標(biāo)。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組.兒童支氣管哮喘防治常規(guī)［J］.中華兒科雜志，2008，46(10):745-753.

［2］Efthimiadis A，Spanevello A，Hamid Q，et al.Methods of sputum processing for cell counts，immunocytochemistry and in situhybridization［J］.Eur Respir J，2002，37(Suppl):19-23.

［3］Pizzichini E，Pizzichini MMM，Efthimiadis A，et al.Indices of airway inflammation in induced sputum:reproducibility and validity of cell and fluidphasemeasurements［J］.Am JRespir Crit Care Med，1996，154(2):308.

［4］Louis R，Potmans V.Analysis of induced sputum in refractory asthma［J］.Presse Med，2008，37(1 Pt2):155-159.

［5］Spanevello A，Migliori GB，Sharara A，et al.Induced sputum to assess airway inflammation:a study of reproducibility［J］.Clin Exp Allergy，1997，27(10):1138-1144.

［6］Gereng EA，Sukhodolo IV，Pleshko RI，et al.Comparative study of eosinophils in the blood and induced sputum during bronchial asthma［J］.Bull Exp Biol Med，2004，137(1):50-52.

［7］Louis R，Lau LC，Bron AO，et al.The relationship between airways inflammation and asthma severity［J］.Am JRespir Crit Care Med，2000，161(1):9-16.

［8］Bergeron C，Boulet LP.Structural changes in airway diseases: characteristics，mechanisms，consequences，and pharmacologic modulation［J］.Chest，2006，129(4):1068-1087.

［9］Ohbayashi H，Shimokata K.Matrixmetalloproteinase-9 and airway remodeling in asthma［J］.Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2005，4(2):177-181.

［10］Suzuki R，Miyazaki Y，Takagi K.Matrixmetalloproteinases in the pathogenesis of asthma and COPD:implications for therapy［J］.Treat Respir Med，2004，3(1):17-27.

［11］Prause O，Bozinovski S，Anderson GP，et al.Increased matrix metalloproteinase-9 concentration and activity after stimulation with interleukin-17 in mouse airways［J］.Thorax，2004，59(4):313-317.

［12］Belleguic C，CorbelM，Germain N，etal.Increased release ofmatrixmetalloproteinase-9 in the plasma of acute severe asthmatic patients［J］.Clin Exp Allergy，2002，32(2):217.

［13］Mercer PF，Shute JK，Bhowmik A，et al.MMP-9，TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patientsduring exacerbation［J］.Respiratory Res，2005，22(6):151.