抗病毒治療后CHB患者HBV多聚酶基因P區突變檢測及分析

趙建強

(濰坊市人民醫院，山東濰坊261041)

目前，慢性乙型肝炎(CHB)已成為危害人類健康的常見疾病之一。臨床上廣泛應用的核苷(酸)類似物能有效抑制體內HBV復制，但HBV多聚酶基因逆轉錄保守區(P區)位點突變可使HBV對該類抗病毒藥物出現耐藥，從而影響臨床治療效果［1，2］。目前已知HBV基因的P區有近10個耐藥位點。2010年7月～2013年7月，我們采用焦磷酸測序法對220例CHB患者HBV多聚酶基因P區突變情況進行了檢測分析，旨在為CHB患者的臨床抗病毒治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期于我院就診的CHB患者220例，男186例，女34例;年齡21～70歲(平均44歲)，其中＜30歲37例、31～40歲53例、41～50歲82例、51～60歲44例、＞60歲4例。均符合2010年9月頒布的中國《慢性乙型肝炎防治指南》［3］診斷標準，排除其他病毒性肝炎。全部患者均接受抗病毒治療1～5 a，抗病毒藥物包括拉米夫定、替比夫定、阿德福偉及恩替卡韋等。全部患者均采集空腹靜脈血3mL，分離血清，置1.5mL離心管中-20℃保存待檢。

當然，也有部分國外媒體由于資料占有不夠充分、意識形態觀念存在差異，亦或是對中國共產黨的“群眾路線”政策理論理解不夠深入、準確等原因，而對此次開展的群眾路線教育實踐活動到底可以在多大程度上解決黨內存在的實際問題顯得信心不足。如美國多維新聞網指出，“按照中共的說法，目前的群眾路線還沒有到治本的階段，只能是先治標才能再治本。這樣的群眾路線與整風運動畢竟才進行了兩年不到，靠這樣的一次整風就奢望根治多年的積弊顯然是不現實的。”［5］甚至還有媒體認為，“此次活動會影響中產階層和溫和的改革者——企業家和知識分子。這種局面也將對中央領導層一直強調的政治穩定產生一定影響。”［14］

公共藝術的主要特征是“公共性”。這種“公共性”主要體現在對空間的運用上和對空間所有者“受眾”的關注上。空間作為公共藝術表現的特殊“場”，是公共藝術存在的“物質”基礎，如何有效的研究空間、利用空間、充實空間、創造空間，是公共藝術實踐的重要手段。而作為空間所有者的“受眾”的審美需求與文化訴求，是公共藝術創作“精神”依托，如何更好地體現關注大眾、服務于大眾，是公共藝術實踐的終極目標。

1.2 HBV多聚酶基因P區耐藥位點突變檢測 將上述靜脈血標本離心、留取血清，以瑞士Roche公司Roche480熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR反應，所有操作按試劑說明書進行。采用套式PCR方法擴增HBV多聚酶基因P區特異性片段，焦磷酸測序法對基因耐藥相關位點進行突變檢測:按照Pyro-Mark ID遺傳分析系統和試劑盒說明書，用單核苷酸多態性(SNP)模式進行PCR產物HBV耐藥相關位點的測序，根據檢測的堿基序列判斷突變類型，根據測序結果計算各耐藥位點的突變情況。基因突變檢測試劑購自杭州迪安公司。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析。組間率的比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

我國是CHB的高發區，故對此類患者的規范化抗病毒治療非常重要。拉米夫定和阿德福韋酯等核苷類藥物能通過抑制HBV復制中的逆轉錄過程顯著降低HBV-DNA載量，且具有毒副作用少、服用簡便等特點，在臨床上已得到廣泛應用。研究［4］顯示，長期使用核苷類藥物會引起HBV多聚酶基因P區發生點突變，而此突變是HBV對核苷類似物抗病毒治療耐藥的分子基礎，也是病毒復制反彈的重要原因之一。目前認為，CHB患者出現抗病毒藥物耐藥性的機理是長期用藥后誘導了HBV多聚酶基因P區發生點突變。

2.2 HBV多聚酶基因P區耐藥位點突變情況 ①204位點及180位點突變:發生rtL180M突變的50例患者中，rtM204V/I全部發生突變(50/50);發生rtM204V/I突變的75例患者中，同時發生rtL180M突變50例(66.67%)、rtL180M+rtA181V/T突變6例、rtL180M+rtV173L突變4例、rtL180M+rtS202G突變1例。②181位點及236位點突變:在發生rtA181V/T突變的30例患者中，同時發生rtN236T突變11例(36.67)、rtN236T+rtM250V突變1例。2.3 不同性別、年齡患者HBV多聚酶基因P區耐藥位點突變率比較 ①性別:男性P區204位點突變率顯著高于女性(見表1)。②年齡:不同年齡組患者P區204位點及180位點突變率有顯著差異，詳見表1(8例61歲以上患者中，180位點突變1例、204位點突變1例，由于病例數少不予統計)。

表1 不同性別、年齡患者HBV多聚酶基因P區耐藥位點突變率比較

3 討論

2.1 HBV多聚酶基因P區耐藥位點突變情況 107例患者檢測出HBV多聚酶基因P區耐藥位點突變，相關位點有173(rtV173L)、180(rtL180M)、181 (rtA181V/T)、184(rtT184A)、202(rtS202G)、204 (rtM204V/I)、236(rtN236T)和250(rtM250V)，其突變率依次為1.81%(4/220)、22.72%(50/220)、13.63%(30/220)、5.90%(13/220)、0.45%(1/220)、34.09%(75/220)、5.00%(11/220)、1.36%(3/220)。按突變率高低排列各位點依次為204＞180＞181＞184＞236＞173＞250＞202，其中204位點和180位點突變率顯著高于其他位點(P＜0.01)。

步驟2：按照式(12)～(14)處理流程，對不連續的虛擬陣列流型進行內插重構，得到連續虛擬陣列流型響應；

HBV多聚酶基因P區突變主要發生于180和204兩個位點。本研究顯示，CHB患者HBV多聚酶基因P區204、180、181、236、184位點突變率較高，尤以204和180位點突變為著;204位點突變率在男性患者顯著高于女性患者，180位點突變率在不同年齡組之間比較均有顯著差異，204位點突變率在＜30歲者與41～50歲、51～60歲者間比較有顯著差異。提示長期使用拉米夫定等核苷類似物可誘發HBV多聚酶基因P區突變，從而產生耐藥;不同性別、年齡患者HBV多聚酶基因P區位點突變率不同。HBV多聚酶基因P區不同位點的突變可單獨或同時發生。曹亦菲等［5］研究顯示，rtM204V聯合rtL180M突變發生率為 91.67%。本研究顯示，rtM204V/I聯合 rtL180M 突變率為 66.67%，rtA181V/T聯合rtN236T突變率達36.67%。提示在核苷類似物臨床耐藥者體內存在P區不同位點的突變，且聯合突變率較高。有研究［6］報道，CHB患者應用核苷類似物治療過程中，基因區不同位點變異可能先后出現，且聯合變異可使病毒的復制能力明顯增強。

總之，抗病毒治療后CHB患者的HBV多聚酶基因P區突變主要集中在204、180位點，對抗病毒治療耐藥的HBV患者進行相關位點突變檢測有利于指導臨床治療。

［1］Sheldon J，Soriano V.Hepatitis B virus escapemutants induced byantiviral therapy［J］.JAntimicrob Chemother，2008，61(4):766-768.

［2］許利軍，潘晨，李勤光，等.拉米夫定治療無良好應答患者乙型肝炎病毒P區突變與基因型的關系［J］.中華肝臟病雜志，2010，18(3):181-183.

［3］中華醫學會肝病學分會、感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(12):881-891.

［4］魏麗榮，劉景院，劉莊.恩替卡韋治療慢性重型乙型肝炎的近期療效［J］.臨床肝膽病雜志，2009，25(1):56-58.

［5］曹亦菲，何平，譚曉華.1012例乙肝病毒患者HBV P區基因位點變異分析［J］.健康研究，2011，31(1):17-20.

［6］Bartholomeusz A，Locarnini S.Hepatitis B virusm utations associated with antiviral therapy［J］.JMed Virol，2006，78(Suppl 1): 52-55.