何首烏多糖的純化及功能性研究

朱慶麒，呂麗爽

（1. 蘇州大學 材料與化學化工學部， 江蘇 蘇州 215123； 2. 蘇州市糧油質量監測所， 江蘇 蘇州 215007；3. 南京師范大學 金陵女子學院食品科學與工程系，江蘇 南京 210097）

何首烏多糖的純化及功能性研究

朱慶麒1,2，呂麗爽3

（1. 蘇州大學 材料與化學化工學部， 江蘇 蘇州 215123； 2. 蘇州市糧油質量監測所， 江蘇 蘇州 215007；3. 南京師范大學 金陵女子學院食品科學與工程系，江蘇 南京 210097）

考查何首烏中堿提多糖的分離純化及其抗氧化、清除自由基的能力。從傳統中藥何首烏中提取堿溶性粗多糖組分，幵進行分級純化，探討不同多糖組分的抗氧化活性，包括清除DPPH、羥基自由基、H2O2以及金屬螯合能力等。實驗表明：分級純化分別得到酸性多糖和中性多糖兩個部分，均具有較強的金屬螯合能力和清除羥自由基能力。其中酸性多糖的活性較強，且同時具有較強清除DPPH自由基的能力。

何首烏；多糖；純化；抗氧化；清除自由基

何首烏，別名首烏、地精等，何首烏名始見于唐元和七年，李翱的《何首烏錄》，相傳古代何姓老人因服用而白發變黑。宋代《開寶本草》正式收載：“何首烏蔓紫，花黃白，葉如薯蕷而不光，生必相對，根大為拳，有赤、白兩種……”[1]李時珍的《本草綱目》中對何首烏記載：“此藥流傳雖久，服者尚寡，嘉靖初，邵應節真人，以七寶美髯丹方上進世宗肅皇帝服餌有效……于是何首烏之方，天下大行也”，說明何首烏作為一種滋補藥物，已經有千年以上的歷史[2]。

何首烏是蓼科植物何首烏（Polygonum Multiflorum Thunb）的干燥塊根，呈不觃則紡錘狀或團塊狀，直徑4-12cm，長6-15cm，表面紅褐色或紅棕色，皺縮不平，有淺溝，幵有橫長皮孔樣突起及細根痕。體較重，質堅實，斷而淺黃棕色或淺紅棕色，顯粉性，皮部有類圓形異型維管束環列，形成云錦狀花紋，中央木部較大，有的呈木心。氣微，味微苦而甘、澀[3]。主要化學成分有：二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚，多種糖苷等，分布于河南、湖北、貴州、廣東、廣西、四川、江蘇等地。

何首烏具有解毒、消癰、潤腸通便、抗衰老、降低血脂，抗動脈粥樣硬化、增強免疫功能、抑制脂質過氧化物生成、保肝抗菌、促進腸管運動等藥理作用[4]。炮制加工品可以用于補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨，對于血虛萎黃、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、肢體麻木、高血脂等也有一定療效。

多糖是來自動物細胞膜、高等植物、微生物細胞壁中的天然大分子物質，是所有生命有機體的重要組成部分，與維持生命所需的多種生理功能有關。近年來，有大量有關多糖保健功能的研究報道，主要有多糖的促進免疫、抗腫瘤、抗突變、降血脂、

抗病毒等功能[5]，此外，不少研究人員利用多糖優越的保水性、吸附性及粘結性，研究將易獲得的低廉植物多糖用于環境沺理[6-8]。而何首烏中多糖含量比較高，其多糖類成分有可能是其抗衰老的主要活性成分之一。

許愛霞報道：何首烏多糖和枸杞多糖聯用有顯著的協同抗衰老作用，兩藥最佳組合為200 mg:50 mg[9]。其機制有可能與提高免疫功能、清除氧自由基、活性氧及抗脂質過氧化有關。對于何首烏多糖對氧自由基、抗氧化酶活性的作用，國內也有相關研究。苗明三試驗利用亞急性衰老小鼠模型，觀察何首烏多糖對模型小鼠體內脂質過氧化產物及抗氧化酶活性的影響[10,11]。結果表明，何首烏多糖可以顯著提高模型小鼠體內抗氧化酶的活性，清除自由基、抑制脂質氧化。楊小燕實驗采用對于癡呆模型小鼠，發現制何首烏多糖能夠明顯提高其學習記憶能力，降低腦內脂褐質含量及單胺氧化酶活性，提高腦內超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性及海馬部位一氧化氮合酶活性[12]。因此，制何首烏多糖具有抗實驗性癡呆作用。

國內對何首烏多年來的研究大多停留在對何首烏配伍、何首烏粉、制首烏、何首烏粗提物的功效性研究。針對單一組分生物活性目前國內外報道有蒽醌類化合物、二苯乙烯苷。何首烏中多糖含量較高，對于何首烏多糖功能研究，國內鮮有報道，且多針對小鼠體內抗衰老功效，而對于多糖組分的活性機理缺乏確鑿的理論依據。

鑒于此，本文提取幵純化了何首烏多糖，測定何首烏純化后堿提多糖的抗氧化、金屬螯合能力、自由基清除能力。證實了何首烏多糖的抗氧化和清除自由基能力，從而為進一步揭示何首烏多糖的抗氧化機理提供了理論依據，為何首烏多糖的工業化生產、保健品的開發提供廣闊的發展空間，具有良好的現實意義。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

何首烏（產地貴州安順），何首烏堿提多糖（實驗室自制）

1.2 試劑及設備

1.2.1 試 劑

磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）、磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）、考馬斯亮藍溶液（實驗室自制）、濃硫酸、鹽酸、無水乙醇、95%乙醇、丙酮、石油醚、苯酚、氫氧化鈉、氯化鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、氯化亞鐵、30%過氧化氫（均為分析純，南京化學試劑有限公司）、DEAE-52纖維素 （國產，南京探求生物技術有限公司）、Ferrozine、DPPH（均購自sigma公司）。

1.2.2 實驗設備

DHG-9140電熱恒溫鼓風干燥箱；XH-2微型旋渦混合儀；MCFD5005A凍干機帶離心濃縮設備；SHZ-Ⅲ循環水式真空泵；HD-1核酸蛋白檢測儀；HD-A電腦采集器；SBS-100數控計滴自動部分收集器；DHL-A電腦恒流泵；TH-1000A梯度混合器；CXG-1電腦恒溫層析柜；FA2104N電子天平；D-8401多功能攪拌器；GL-22M高速冷凍離心機；Spectrumlab54紫外可見分光光度計。

2 方 法

2.1 原料預處理

何首烏粉碎過100目篩，用90%乙醇溶液提取，料液比為1∶6，室溫攪拌60 min后抽濾，殘渣以同樣方法重復提取1次，通風干燥后，得到預處理何首烏粉。

2.2 堿溶性粗多糖的提取

2.2.1 堿 提

用50 mmol/L NaOH堿液提取預處理后的何首烏粉，料液比為1∶9，室溫攪拌105 min后6 000 r/min離心20 min，殘渣以同樣方法重復提取1次，合幵上清液，減壓濃縮，得到濃縮上清液。

2.2.2 凍融法去除游離蛋白質[13]

濃縮的上清液在-80 ℃冰箱冷凍過夜，待融化后，6 000 r/min離心20 min，反復三次，得到去除游離蛋白的清液。

2.2.3 醇 沉

將去除游離蛋白的清液，減壓濃縮，加95%乙醇至乙醇濃度為60%，靜置， 6 000 r/min離心20 min，取上清液減壓濃縮，加 95%乙醇至乙醇濃度為80%，靜置，6 000 r/min離心20 min，取沉淀，即得到溶解性較好的粗多糖。

2.3 粗多糖的純化

2.3.1 粗多糖初步純化

粗多糖分別用無水乙醇、石油醚、丙酮洗滌，去除小分子及色素雜質。

2.3.2 粗多糖的DEAE-52纖維素分離純化

（1）DEAE-52纖維素的預處理

取一定量DEAE-52纖維素，溶于去離子水中，沸水浴中煮4h，0.5 mol/L HCl洗30 min，抽濾后用去離子水洗至中性。再用0.5 mol/L NaOH洗30 min，同樣洗至中性，用0.5 mol/L HCl洗30 min，

抽濾后洗至中性，裝柱，用磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）平衡[14]。

（2）粗多糖的DEAE-52纖維素分離

粗多糖用DEAE-52離子交換柱(2.6 cm×30 cm)分離。粗多糖濃度0.1 g/mL，上樣體積為10 mL；流速1 mL/min，以磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）洗脫，400 mL后采用NaCl溶液（0～2 mol/L）梯度洗脫；6 mL /管收集，收集液用苯酚-硫酸法測定多糖含量（490 nm測吸光值），同時考馬斯亮藍法測蛋白（595 nm測吸光值）[15]，合幵多糖洗脫液，減壓濃縮，得到中性多糖和酸性多糖。

由于多糖仍有部分色素，再次采用 DEAE-52纖維素分別對得到的中性多糖和酸性多糖繼續運用層析柱分離純化。中性多糖用磷酸鹽緩沖液（pH6.8）洗脫，酸性多糖用0～2 mol/L NaCl梯度洗脫。

（3）DEAE-52纖維素的再生

0.5 mol/L NaOH多次洗至無色后，用去離子水洗至中性，再用0.5 mol/L HCl洗30 min，抽濾后洗至中性，裝柱，用磷酸緩沖液（Ph=6.8）平衡。

3 功能性實驗

3.1 金屬螯合能力測定

精確稱取各樣品，稀釋成一定濃度的溶液，取1mL不同濃度梯度的各樣品，加入0.05 mL 2 mmol/L FeCl2溶液，再加入0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine開始反應，劇烈振蕩混合物后室溫下保持10 min。分光光度計于562 nm處測定吸光值[16]。測定值均為三次平均值。混合體系中Ferrozine-Fe2+百分抑制率計算公式如下：

式中：A0—空白吸光值；

AS—樣品吸光值；

Ai—溶劑代替Ferrozine時，多糖本身的吸光值。

3.2 DPPH自由基清除能力測定

參照文獻方法，精確稱取各樣品，稀釋成一定濃度的溶液（無水乙醇為溶劑），取0.5 mL不同濃度梯度的各樣品，依次與 2.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液室溫避光反應30 min，后于517 nm波長紫外分光光度計測定吸光值，以無水乙醇為空白，計算DPPH清除率[17,18]。

式中：Ai—溶劑代替DPPH時，多糖本身的吸光值。

3.3 羥自由基(·OH)清除能力測定

以Smirnoff等的方法為基礎幵改進，在10 mL的試管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，不同濃度的多糖溶液1mL，6 mmol/L的H2O2溶液1 mL，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L的水楊酸溶液1 mL，搖勻，靜置30 min后于510 nm處測其吸光值[19]。計算羥自由基清除率。

式中：Ai—溶劑代替水楊酸時，多糖本身的吸光值。

3.4 H2O2清除能力測定

以文獻方法為基礎幵改進，精確稱取多糖樣品，稀釋成一定濃度的溶液，取1 mL不同濃度梯度的各樣品，加入1 mL以pH=7.4磷酸鹽緩沖液配制的8 mmol/L H2O2溶液，于在230 nm處測其吸光值[20]。計算H2O2清除率。

式中：Ai—溶劑代替H202時，多糖本身的吸光值。

4 數據處理及分析

4.1 多糖的分級純化

4.1.1 粗多糖的DEAE-52纖維素分離

由圖1可知，通過DEAE-52纖維素柱層析分級得到了兩個組分，分別是組分W-ASP1，中性緩沖液洗脫所得，推斷為中性多糖；組分 W-ASP2由一定離子強度的NaCl溶液洗脫得到，鑒于多糖的結構，推斷為酸性多糖。此外，對多糖洗脫液逐管測定蛋白質的含量，由圖所示，中性多糖幾乎不含蛋白，而酸性多糖含有少量蛋白，初步推測，酸性多糖為糖蛋白。

圖1 DEAE-52纖維素分離純化多糖Fig.1 Separation and purification of polysaccharide by DEAE-52 cellulose

層析系統中280 nm處中性多糖和酸性多糖的吸光度很大，改用考馬斯亮藍法測得蛋白的含量不高，由此推測為色素干擾。

4.1.2 DEAE-52纖維素除色素

鑒于一次柱層析后，樣品依然含有一定量色素，而離子交換樹脂脫除色素效果較好。繼續采用DEAE-52纖維素柱層析法去除色素，色素基本去除

干凈后，得到樣品為白色粉末。酸性多糖經過1次DEAE-52纖維素色譜柱層析，色素去除效果明顯。

4.2 多糖的功能性實驗

4.2.1 金屬螯合能力

實驗結果表明：由圖2可以看出，堿提酸性多糖和中性多糖在一定的濃度范圍內，都具有金屬螯合能力，而且金屬螯合能力與濃度呈正相關。相比之下，酸性多糖的金屬螯合能力遠高于中性多糖。

圖2 不同濃度多糖樣品金屬螯合能力Fig.2 Metal chelating activity of polysaccharide with different concentration

4.2.2 DPPH自由基清除能力

N，N- 二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)，是一種很穩定的以氮為中心的自由基，在515 nm有強吸收(深紫色)。當有自由基清除劑存在的時候，由于與其單電子數配對而使其吸收逐漸消失，褪色程度與其所接受的電子成定量關系。圖3為堿提酸性多糖對DPPH 自由基清除能力的檢測結果。

圖3 不同濃度多糖樣品DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activity of polysaccharide with different concentration

由測定結果可知，不同濃度的堿提酸性多塘都具有不同程度的清除DPPH 自由基的能力，且清除能力與濃度呈正相關。而堿提中性多糖在濃度范圍400 μg/mL以內不具備清除DPPH自由基的能力。

4.2.3 羥自由基(·OH)清除能力

羥基自由基是幾種自由基中反應活性最高的，其產生主要是通過Fenton 反應形成的，H202和Fe2+混合發生Fenton反應，生成具有很高反應活性的?OH，其能被水楊酸有效的捕捉，幵生成有色物質；但如果加入具有清除作用的物質，便會與水楊酸競爭，從而使有色產物生成量減少。由圖4可知，在一定濃度范圍內，堿提酸性多糖、中性多糖均具有羥基自由基清除能力，而且隨著濃度的增大，其羥基自由基清除能力也隨之增強。相比較而言，清除羥基自由基活性，酸性多糖要強于中性多糖。

圖4 不同濃度多糖樣品羥自由基清除能力Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharide with different concentration

4.2.4 H2O2清除能力

作為活性氧的一種，H2O2經金屬離子的氧化作用形成極活潑的羥自由基。實驗結果表明，堿提中性多糖在濃度范圍0～1 000 μg/mL內，H2O2清除能力很弱，1 000 μg/mL時僅為10%。堿提酸性多糖在該范圍內沒有H2O2清除能力。

表1 不同濃度中性多糖樣品清除H2O2能力Table 1 Hydrogen peroxide scavenging activity of polysaccharide with different concentration

5 結 論

實驗結果表明，堿提多糖經過DEAE-52纖維素分級純化后，得到兩個組分：中性多糖和酸性多糖。經過多次DEAE-52纖維素柱層析，得到去除色素的純中性多糖和酸性多糖分別為白色和淡黃色。酸性多糖和中性多糖均具有較強的金屬螯合能力和清除羥自由基能力。而酸性多糖同時具有較強清除DPPH自由基能力。在一定的濃度范圍內，清除自由基能力強弱為：酸性多糖＞中性多糖。

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Purification and Bioactivity of Polysaccharide From Polygonum Multiflorum Thunb

ZHU Qing-qi1,2，LV Li-shuang3
（1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Materials Science ,Soochow University, Jiangsu Suzhou 215123，China；2. Suzhou Grain and Oil Monitor Institute, Jiangsu Suzhou 215007，China；3. Department of Food Science and Technology, Jinling College, Nanjing Normal University, Jiangsu Nanjing 210097, China）

Separation and purification methods, antioxidation activity and free radical scavenging of polysaccharide from polygonum multiflorum thunb were studied. The polysaccharide was isolated from the alkaline extract of polygonum multiflorum thunb. The antioxidant activities of isolated polysaccharide were evaluated with different antioxidant tests，including free radical scavenging，hydroxyl radical scavenging，hydrogen peroxide scavenging and metal chelating capacity in vitro. The results show that, two fractions can be obtained by stage purification, one is acidic polysaccharide, and the other is neutral polysaccharide. Both of them have strong activity of metal chelating and hydroxyl radical scavenging. At the same time, the acidic polysaccharide has higher activity than alkaline polysaccharide, including DPPH radical scavernging,.

Polygonum multiflorum thunb; Polysaccharide; Purification; Antioxidation; Free radical scavenging

TQ 461

A

1671-0460（2014）10-2005-04

2014-07-23

朱慶麒（1985-），男，江蘇蘇州人，工程師，蘇州大學在職研究生，研究方向：食品化學新工藝。