Apelin—13對實驗性自身免疫性神經炎大鼠淋巴結中炎癥因子TNF—α、IL—6和IFN—γ表達的影響

吳崢嶸（等）

[摘要] 目的 觀察Apelin-13對實驗性自身免疫性神經炎（EAN）大鼠淋巴結中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和干擾素-γ（IFN-γ）表達的影響。 方法 采用周圍神經髓鞘抗原（P257-81）注射入Lewis大鼠后肢足墊誘導EAN模型。Lewis雄性大鼠隨機分為對照組、EAN模型組和Apelin處理組。Apelin處理組于免疫當天至第15天每天尾靜脈注射Apelin-13（0.1 mg/kg）。觀察各組大鼠發病情況和坐骨神經組織病理學變化，采用實時定量PCR和Western blot檢測淋巴結中TNF-α、IL-6和IFN-γ表達。 結果 與EAN模型組比較，Apelin處理組大鼠最初發病時間明顯延長，高峰期臨床評分顯著降低，炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ的表達顯著降低（均P < 0.05）。 結論 Apelin-13對實驗性自身免疫性神經炎大鼠有治療作用，其機制可能與下調TNF-α、IL-6和IFN-γ的表達有關。

[關鍵詞] Apelin；實驗性自身免疫性神經炎；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6；干擾素-γ

[中圖分類號] R741.05 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）02（a）-0017-04

Effect of Apelin-13 on the expression of TNF-α， IL-6 and IFN-γ in experimental autoimmune neuritis rats

WU Zhengrong1，2 TAN Liming1 ZHAO Xin1 XIAO Yanjiao1 WANG Zhili1 YANG Li1

1.Department of Neurology， the Second Xiangya Hospital， Central South University， Hu'nan Province， Changsha 410011， China； 2.Department of Neurology， the People's Hospital of Lengshuijiang City， Hu'nan Province， Lengshuijiang 417500， China

[Abstract] Objective To observe the effects of Apelin-13 on the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6） and interferon-γ （IFN-γ） of lymph node in experimental autoimmune neuritis （EAN） rats. Methods The rats models of EAN were established by injection of peripheral nerve myelin sheath antigen （P257-81） in the foot pad of male Lewis rats. The rats were randomly divided into the control group， EAN model group， and Apelin treatment group. The rats in Apelin treatment group were injected with Apelin-13 （0.1 mg/kg） by tail vein once daily from the 1st day to the 15th day. The clinical incidence and pathology in the rats were assessed. The expressions of TNF-α， IL-6 and IFN-γ in lymph node were measured by real-time PCR and Western blot respectively. Results Compared with the EAN model group， the initial time of nervous symptom significantly increased， the maximal neurological score significantly decreased， the expressions of TNF-α， IL-6 and IFN-γ in lymph node significantly decreased in Apelin treatment group （all P < 0.05）. Conclusion Apelin-13 can treat the EAN in EAN rats model， the mechanism of which may be related with down-regulation of TNF-α， IL-6 and IFN-γ.

[Key words] Apelin； Experimental autoimmune neuritis； Tumor necrosis factor-α； Interleukin-6； Interferon-γ

吉蘭-巴雷綜合征（guillain barre syndrome，GBS）是一種常見的周圍神經系統自身免疫性疾病，也稱格林巴利綜合征[1]。實驗性自身免疫性神經炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）是目前公認的研究GBS發病機制的經典動物模型[2-3]。在EAN發病機制中，活化的T細胞及其釋放的促炎癥細胞因子起到了至關重要的作用，影響著疾病的發生、發展和轉歸，如干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等[4-5]。

Apelin是1998年由Tatemoto等從牛胃的分泌物中分離提取出的G蛋白耦聯受體血管緊張素受體AT1相關的受體蛋白（putative receptor protein related to the angiotensinreceptor AT1，APJ）的天然配體[6]。Apelin/APJ在神經系統中廣泛分布，對神經系統具有保護作用。Apelin能對抗興奮性毒性、缺血-再灌注和氧化應激等對神經細胞的損傷以及抑制神經細胞的凋亡[7-9]。因此，本研究擬觀察Apelin-13對EAN大鼠的保護作用及對淋巴結組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ表達的影響，以探討Apelin-13對EAN的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

周圍神經髓鞘抗原（P257-81）為上海吉爾生化有限公司產品。Apelin為美國Sigma公司產品?？俁NA提取試劑盒、MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒、DNA Marker和Hot Star Taq Master Mix試劑盒為Invitrogen公司產品。引物由上海生物工程公司合成。BCA蛋白定量試劑為Pierce公司產品。TNF-α、IL-6、IFN-γ和β-actin抗體以及辣根過氧化物酶標記二抗為美國Santa Cruz產品。

1.2 動物分組及模型制備

健康清潔級雄性Lewis大鼠36只，10周齡左右，體質量200～220 g，由中南大學實驗動物學部提供，以標準飼料喂養。將大鼠隨機分為三組：對照組（12只）、EAN模型組（12只）、Apelin處理組（12只 ）。EAN模型組和Apelin處理組大鼠經雙后肢足墊下注射200 μL抗原乳劑（含200 μg P257-81的生理鹽水100 μL 和完全弗氏佐劑100 μL 混合成的水乳劑）。免疫后當天Apelin處理組大鼠給予Apelin-13（0.1 mg/kg）尾靜脈注射，1次/d，連續15 d；對照組和EAN模型組大鼠同期給予同等劑量的生理鹽水尾靜脈注射。

1.3 大鼠臨床評分

免疫后每天對大鼠神經系統體征進行評分，EAN評分標準：0分：無明顯異常；1分：鼠尾松弛無力，肌張力降低；2分：尾癱，翻正反射部分消失；3分：翻正反射部分消失；4分：存在共濟失調，姿態異常；5分：后肢輕癱；6分：中度癱瘓；7分：后肢嚴重癱瘓；8分；四肢癱瘓；9分：瀕臨死亡；10分：死亡[10]。

1.4 坐骨神經病理學觀察

免疫后第15天，斷頭處死大鼠，迅速取出取大鼠坐骨神經，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片行HE染色，光學顯微鏡下觀察坐骨神經病理改變。

1.5 實時定量PCR檢測

免疫后第15天，斷頭處死大鼠，迅速取出大鼠腹股溝淋巴結，進行組織勻漿，Trizol提取淋巴結組織總RNA。以提取的總RNA為模板進行逆轉錄反應，合成cDNA第一鏈。取cDNA樣品梯度稀釋，進行實時定量PCR反應，反應總體系為30 μL，包含1 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），4 μL cDNA，1 μL雙鏈DNA特異性結合的熒光染料（SYBR Green ONE）（50×），上下游引物各1 μL，8 μL dNTP Mix （2×），其余用蒸餾水補足。TNF-α引物：上游：5′-TGATCGGTCCCAACAACGA-3′，下游： 5′-TGCTTGGTGGTTTGCTACGA-3′。IL-6引物：上游：5′-TGGACTCTGAGCCGCATTGA-3′，下游：5′-GACGCATGGCGGACAATAGA-3′。IFN-γ引物：上游：5′-AAAGACAACCAGGCCTAGA-3′，下游：5′-CTAATCCGCTTCGTTAGGCT-3′。β-actin引物：上游：5′-CGATCATCTTCCAGGAGCG-3′，下游：5′-CTTGCAGTGTGCTATACTCG-3′。反應條件為：95 ℃，10 s；62 ℃，30 s；共進行45個循環。采用2-△△CT法處理數據，以對照組為100%，對目的基因的mRNA表達進行分析。

1.6 Western blotting檢測

免疫后第15天，斷頭處死大鼠，迅速取出取大鼠腹股溝淋巴結，提取淋巴結組織總蛋白，BAC法蛋白定量。100 μL樣本加入到2×SDS凝膠加樣緩沖液中煮沸。凝膠電泳1 h分離蛋白質，分離的蛋白轉膜至聚偏氟乙稀膜上。10%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗鼠TNF-α、IL-6、IFN-γ和β-actin一抗，4℃過夜。加入羊抗兔二抗，孵育6 h。顯影后進行半定量分析。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物發病情況和病情評分

如表1所示：與EAN模型組比較，Apelin處理組大鼠發病時間明顯延遲（P < 0.05）。在致敏的第16天，Apelin處理組大鼠的臨床評分與EAN模型組比較顯著降低（P < 0.05）。

表1 動物發病情況和病情評分（x±s）

注：與EAN模型組比較，*P < 0.05

2.2 坐骨神經病理改變

結果如圖1所示：EAN模型組大鼠坐骨神經神經束間和神經束內有大量的炎癥細胞浸潤，存在局灶性脫髓鞘現象，而對照組大鼠坐骨神經神經束間和神經束內未見明顯炎癥細胞浸潤和脫髓鞘現象。與EAN模型組比較，Apelin處理組大鼠坐骨神經神經束間和神經束內炎癥細胞浸潤和脫髓鞘現象明顯減少。

圖1 坐骨神經病理改變（HE染色，×400）

2.3 淋巴結中炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ的表達

結果如表2和圖2所示：與對照組比較，EAN模型組大鼠淋巴結組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ mRNA和蛋白的表達水平顯著升高（均P < 0.05）。與EAN模型組比較，Apelin處理組大鼠淋巴結組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ mRNA和蛋白表達水平顯著降低（均P < 0.05）。

表2 淋巴結中炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ mRNA的

相對表達水平（%，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05；與EAN模型組比較，#P < 0.05；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素-6；IFN-γ：干擾素-γ

與對照組比較，*P < 0.05；與EAN模型組比較，#P < 0.05；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素-6；IFN-γ：干擾素-γ

圖2 淋巴結中炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ蛋白表達情況

3 討論

GBS是神經科常見的外周神經脫髓鞘疾病，臨床上表現為進行性對稱性兩腿無力、遲緩性癱瘓、腱反射降低或消失，部分患者輕度肌萎縮、肢體遠端感覺異常等[11]。病理學特征主要為外周神經組織炎細胞浸潤和脫髓鞘改變。目前GBS的病因和發病機制尚未完全明了。研究表明，GBS主要是一種由CD4+T細胞介導的涉及體液免疫和細胞免疫的自身免疫性疾病[12]。1955年Wakesman和Adams首次提出了EAN的概念。EAN也是由CD4+T細胞介導的以外周神經組織炎細胞浸潤和脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病[13]。EAN和GBS在臨床表現、病理學特征、神經電生理學改變及免疫學發病機制等多方面都非常相似，因此，被廣泛用于對GBS發病機制及治療的研究，是目前公認的研究GBS理想的動物模型。

在GBS以及其動物模型EAN的發病中細胞因子具有十分重要的作用，在GBS和EAN中促炎癥細胞因子的水平增加，而促炎癥細胞因子和抑炎癥細胞因子之間的平衡直接影響著GBS和EAN的發生發展和轉歸。參與GBS和EAN的促炎癥細胞因子有很多，包括TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-1、IL-17等[14]。研究表明，GBS患者血清TNF-α水平明顯高于正常人，TNF-α水平與GBS病情嚴重程度呈正相關，血清TNF-α水平的降低有利于疾病的恢復[15]。IFN-γ是由CD4+Th1細胞和神經組織內NK細胞分泌的促炎癥細胞因子，參與了多種自身免疫性疾病的發生發展。IFN-γ可激活巨噬細胞釋放氧自由基，促進巨噬細胞和T淋巴細胞向神經系統的遷移，促進巨噬細胞上MHCⅡ類分子的表達，從而促進EAN的炎性反應[16]。

Apelin是由Tatemoto等在1998年通過反向藥理學方法從牛的胃分泌物中分離純化的一種小分子內源性神經肽，是APJ的天然配體[17]。Apelin/APJ在神經系統中有廣泛的分布，研究表明，Apelin/APJ具有神經保護作用，能對抗興奮性毒性損傷、氧化應激損傷，抑制神經細胞的凋亡等，是一種內源性神經保護因子。研究發現，海馬細胞中有APJ和Apelin的表達，Apelin能誘導Akt和Raf/ERK1/2的磷酸化，對抗N-甲基-D-門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）對海馬神經元的興奮性毒性損傷[18]。Apelin能抑制大腦皮質細胞中活性氧的產生、細胞色素C的釋放以及caspase-3的激活，促進Akt和ERK1/2的磷酸化，抑制大腦皮質細胞凋亡[19]。Apelin可通過活化三磷酸肌醇IP3、PKC、MEK1/2和ERK1/2調節NMDA受體的NR2B亞單位的1480絲氨酸磷酸化，減少Ca2+積聚，降低鈣蛋白酶calpain的活化，保護大腦皮質神經元抵抗谷氨酸的興奮性毒性損傷[20]。

本研究結果顯示，Apelin-13改善了EAN的臨床癥狀，延遲了發病的時間，縮短了病程，明顯減少了坐骨神經炎癥細胞浸潤，也明顯減輕了坐骨神經髓鞘脫失程度。Apelin-13降低了促炎癥細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平，對EAN的預后起著積極的作用。這些結果表明，Apelin-13對EAN大鼠有治療作用，其機制可能與下調促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ的表達有關。本研究闡明了Apelin是一種具有應用于GBS治療潛能的有效藥，為GBS的臨床治療提供一些新的思路和策略。

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（收稿日期：2013-11-01 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2013-11-01 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2013-11-01 本文編輯：程 銘）