血管生成素—2及血管內皮細胞因子在星形細胞瘤中表達情況及其相關性研究

王玉亭++++++周垂賢（等）

[摘要] 目的 研究血管生成素-2（Ang-2）、血管內皮生長因子（VEGF）在人腦星形細胞瘤中的表達及其與星形細胞瘤惡性程度之間的相關性。 方法 采用免疫組化方法檢測60例人腦星形細胞瘤和12例健康腦組織中Ang-2及VEGF蛋白的表達。實驗數據采用SPSS 10.0軟件行χ2檢驗、Spearman等級相關分析，分析它們的表達情況和相關性。 結果 60例星形細胞瘤組織中有39例（65.00%）出現Ang-2蛋白陽性表達，35例（58.33%）出現VEGF蛋白陽性表達；其陽性表達率均高于健康腦組織（16.67%、16.67%），且差異有統計學意義（P < 0.05），隨著星形細胞病理分級的提高，Ang-2及VEGF蛋白陽性表達率也逐漸增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。Ang-2與VEGF的表達呈正相關（r=0.8649，P < 0.05）。 結論 Ang-2和VEGF的表達與星形細胞瘤惡性程度密切相關，且在星形細胞瘤的發生、發展過程中起重要作用。

[關鍵詞] 星形細胞瘤；血管生成素-2；血管內皮生長因子

[中圖分類號] R730.231 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）02（a）-0013-04

Expression and correlation study of angiogenin-2 and vascular endotheliai growth factor in astrocytoma

WANG Yuting ZHOU Chuixian WANG Daokui▲ WANG Jinpeng QIN Shiqiang

Department of Neurosurgery， Weifang People's Hospital， Shandong Province， Weifang 261021， China

[Abstract] Objective To study the expressions of angiogenin-2 （Ang-2） and vascular endotheliaI growth factor （VEGF） in astrocytoma and their correlations with the grade malignancy of astrocytoma. Methods The expressions of Ang-2 and VEGF from astrocytoma in 60 patients and from 12 cases of healthy brain tissues were detected by immunohistochemical method. Data from the experiment were analyzed by SPSS 10.0 using chi-square and Spearman rank correlation， in order to observe the expression and correlation. Results Among 60 patients with astrocytoma， there were 39 cases （65.00%） with Ang-2 protein in positive expression and 35 cases （58.33%） with VEGF protein in positive expression. The positive expression rates in astrocytoma tissue were both higher than those in the healthy brain tissue （16.67%， 16.67%）， which displayed significant differences （P < 0.05）. With pathological grading of astrocyte advancing， the positive expression rates of Ang-2 and VEGF gradually increased with statistical difference （P < 0.05）. In addition， there was positive correlation between Ang-2 and expression of VEGF （r=0.8649， P < 0.05）. Conclusion Expressions of Ang-2 and VEGF are closely related with the grade malignancy of astrocytoma， and they play important roles in the occurrence and development of astrocytoma.

[Key words] Astrocytoma； Angiogenin-2； Vascular endotheliai growth factor

星形細胞瘤是中樞神經系最常見的原發腫瘤，占顱內原發腫瘤的60%[1]，預后不良。星形細胞瘤無論分化高低均在腦內呈浸潤性生長，星形細胞瘤的發生和侵襲是一個多步驟的復雜過程，眾多研究已表明腫瘤血管形成在星形細胞腫瘤生長及浸潤中起重要作用。

近來研究發現，血管生成素（angiopoietin，Ang）作為新的內皮生長因子家族，共有4個亞型，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4，目前對Ang-1、Ang-2的研究較深入，尤其是Ang-2在腫瘤組織中的表達明顯高于周圍正常組織，且特異表達于腫瘤邊緣的血管重建區，在腫瘤早期血管增生、維持及后期血管增生延續的惡性循環中起重要作用[2]。血管內皮生長因子（VEGF）是一種多功能的細胞因子，其作用包括促進血管內皮細胞增殖、提高血管的通透性、促進血管支持物的生成、抑制腫瘤細胞的凋亡等。

Ang-2及VEGF在其他腫瘤中的相關性已有不少研究，但在星形細胞瘤中尚未研究，本研究主要研究其在星形細胞瘤中的表達情況以及它們之間的相關性。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

人腦星形膠質細胞瘤標本60例，取自濰坊市人民醫院腦科醫院神經外科2008年1月～2009年10月手術患者的存檔蠟塊，均經病理證實。患者術前均未接受放療和化療，年齡為5～73歲，平均（38.2±7.1）歲，其中，< 40歲27例（45%），≥40歲33例（55%）；男35例，女25例，男女比例為1.4∶1；腫瘤位于幕上者39例，幕下者21例；腫瘤> 3 cm者19例，≤3 cm者41例；腫瘤全切46例（76.7%），腫瘤部分切除14例（23.3%）；術前卡氏（KPS）評分> 70分49例（81.7%），KPS評分< 70分11例（18.3%）。選擇顱內深部腫瘤切除術時表淺的腦組織12例作為對照，經病理證實均為健康腦組織；其中，男7例，女5例；額葉4例，頂葉2例，顳葉4例，小腦2例。

參照WHO（2000年）分級標準將患者分為四組：Ⅰ級16例，Ⅱ級15例，Ⅲ級15例，Ⅳ14例。為了便于統計學描述和分析，將Ⅰ、Ⅱ級歸為低度惡性腫瘤，Ⅲ、Ⅳ歸為高度惡性腫瘤。

1.2 試劑

一抗：鼠抗人Ang-2單克隆抗體（即用型，定位于細胞漿）；鼠抗人VEGF單克隆抗體（即用型，定位于細胞膜和細胞漿）；二抗：通用型PV-6000二步法免疫組化試劑盒。均由京中杉金橋生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 蠟塊制備和組織制片

組織標本用10%中性甲醛固定，酒精脫水，用二甲苯將標本做透明處理，并于溫箱內將透明組織溶于石蠟內，常規石蠟包埋，用切片機制作4 μm切片標本。

1.3.2 免疫組化方法

將石蠟切片脫蠟，水化組織切片，用3%H2O2去離子水孵育5 min，滴加抗體，應用DAB溶液顯色，再用蒸餾水沖洗、復染、脫水、封片，完成免疫組化PV-6000二步法。在光學顯微鏡下，以背景無顏色，細胞漿和（或）細胞膜內被染成棕黃色顆粒作為Ang-2、VEGF蛋白陽性染色（即為陽性細胞），每張切片觀察300個細胞，對陽性細胞進行計數。

1.3.3 結果判斷

1.3.3.1 Ang-2蛋白染色結果判定 參照相關文獻[3-4]采取半定量計數法進行評判，即在高倍鏡（400×）下隨機記錄5個視野，按著色細胞染色強弱計分：陰性為0分，弱陽性（淡黃色）為1分，陽性（黃色）為2分，強陽性（棕黃色）為3分。陽性細胞百分比評價標準：<10%為0分，10%～< 30%為1分，30%～< 50%為2分，≥50%為3分。根據這兩項指標的積分之和分為4級：0分為（-），1～2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。

1.3.3.2 VEGF蛋白染色結果判定 參照相關文獻[5]采取半定量計數法進行評判，染色強度得分標準為：陰性為0分，弱陽性（淡黃色）為1分，陽性（黃色）為2分，強陽性（棕黃色）為3分。陽性細胞百分比評價標準為：<5%計0分，5%～< 25%計1分，25%～< 50%計2分，50%～75%計3分。上述兩項分值相加得0分為（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性檢驗采用Spearman等級相關分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ang-2蛋白在星形膠質細胞瘤和健康腦組織中的表達

本研究中，健康腦組織與星形細胞瘤中Ang-2蛋白陽性表達率分別為16.67%（2/12）和65.00%（39/60），Ang-2在星形細胞瘤中的陽性表達率明顯高于健康腦組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。高級別星形細胞瘤組織中（Ⅲ級+Ⅳ級）Ang-2的陽性表達率明顯高于低級別星形細胞瘤組織（Ⅰ級+Ⅱ級），差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

表1 血管生成素2蛋白在不同級別星形細胞瘤中的表達情況（例）

2.2 VEGF蛋白在星形細胞瘤和健康腦組織中的表達

本研究中，健康腦組織與星形細胞瘤中VEGF蛋白陽性表達率分別為16.67%（2/12）和58.33%（35/60），星形細胞瘤組織中VEGF的陽性表達率明顯高于健康腦組織（P < 0.05）。高級別星形細胞瘤組織中（Ⅲ級+Ⅳ級）VEGF的陽性表達率明顯高于低級別星形細胞瘤組織（Ⅰ級+Ⅱ級），差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 Ang-2與VEGF蛋白表達等級相關分析

Ang-2蛋白的表達與VEGF蛋白表達均呈顯著正相關性（r=0.8649，P < 0.05）。見表3。

表3 Ang-2蛋白與VEGF蛋白表達相關性情況（例）

注：Ang-2：血管生成素2；VEGF：血管內皮生長因子

3 討論

3.1 Ang-2在膠質瘤血管生成中的作用

Ang-2屬于酪氨酸激酶受體Tie-2的配基之一。Ang-2與Tie-2結合，能促進內皮細胞生長、腫瘤細胞的生長和血管生成。Ahmad等[6]研究發現，轉染Ang-2的移植瘤體積明顯增大，血管密度增加，提示Ang-2有促進腫瘤血管生成的作用。目前關于腫瘤生長的最新觀點認為[7]，腫瘤生長的早期，腫瘤細胞與宿主共擇并形成一個血供較好的血管區，但這些血管并不隨腫瘤的生長而增生，而是發生了退化，Ang-2此時也表達增多。其可能的原因是由于瘤細胞生長快，代謝能力強于健康組織，此時機體自分泌Ang-2進行“自殺性防御”，破壞被腫瘤組織占據的血管，以達到阻止腫瘤生長的目的。此時腫瘤組織表現為血管退化，腫瘤細胞凋亡，組織壞死。之后，邊緣殘余的腫瘤細胞為了生存，在缺氧的環境下，生成大量的VEGF。

Ang-2對新生毛細血管的作用主要表現在，Ang-2一開始通過拮抗Ang-1而破壞腫瘤血管，同時也松解了血管結構，消除血管基底膜和周圍細胞對血管形成的限制，并激活了內皮細胞。之后，在殘余腫瘤細胞大量分泌VEGF的情況下，對VEGF較敏感的內皮細胞便迅速發生增殖、侵襲和遷徙，新生血管開始芽生。但由于Ang-2的持續高表達拮抗了Ang-1的作用，所以新生的腫瘤血管壁不完整，且滲透性高[8]。本實驗研究結果顯示，Ang-2、VEGF均在星形細胞瘤中呈高陽性表達（65.00%，58.33%），且其二者具有高度相關性（r=0.8649）也佐證了這一點。Holash等[9]建立了鼠C6神經膠質瘤腫瘤模型，發現在腫瘤直徑>1 mm時，腫瘤血管的內皮細胞Ang-2可強表達；當腫瘤細胞出現壞死時，在壞死中央的腫瘤血管見Ang-2強表達，在邊緣腫瘤中亦可見Ang-2呈強表達。Koga等[10]研究表明，膠質瘤細胞和血管內皮細胞均有Ang-2表達，高級別膠質瘤Ang-2表達陽性細胞數及染色強度均高于低級別膠質瘤。這與本文研究顯示的惡性程度高的星形細胞瘤組織Ang-2蛋白表達明顯高于惡性程度低的星形細胞瘤組織的表達相一致。

3.2 VEGF在膠質瘤血管生成中的作用

VEGF是一種多功能的細胞因子。近來研究表明，VEGF是新生血管形成的中心調控因子，其主要功能包括：①增加腫瘤細胞的血供。由于腫瘤細胞在快速生長過程中對氧和營養的需求量過大，易導致腫瘤組織內缺血缺氧，而缺氧恰為VEGF最強烈的誘導劑，因而導致VEGF大量分泌，并特異性與VEGF受體相結合，加速血管內皮細胞的增生和分化，促使新生血管生成，以滿足腫瘤生長的需求。腫瘤的惡性程度越高、體積越大、轉移范圍越廣及浸潤程度越深，則對氧的需求越高，故VEGF的分泌越多，并且二者呈正相關[11]。②VEGF可激活血管內皮細胞基因，增強尿激酶型纖溶酶原激活物和組織型纖溶酶原激活物，并減弱纖溶酶原激活劑抑制物（PAI-1）的表達，進而誘導蛋白水解酶、間質膠原酶和組織因子的產生來促進血管的形成[12]，改善癌細胞營養和氧的需求。③VEGF促使血管內皮細胞產生金屬蛋白酶-9（MMP-9），使凝血酶原轉化為凝血酶，激活明膠酶原A降解原來的基膜，促使血管形成[13-14]，使腫瘤營養和氧供給加大。④VEGF可通過細胞內鈣調節蛋白及磷酸肌酶途徑增強一氧化氮合酶（NOS）表達，導致一氧化氮生成增多，進而促進新生血管網建立和管腔的形成[15-16]。大量研究證實，VEGF及其受體在大多數人的腫瘤細胞分泌和表達，它通過不同的途徑供應腫瘤營養。Vlom等[17]研究發現，肺癌組織中VEFG高表達，并證實了腫瘤細胞可產生VEGF，VEGF的旁分泌機制和腺、鱗癌組織中VEGF表達程度不同。索新等[18]也發現，VEGF在人腦膠質瘤中高表達。本實驗研究結果顯示，VEGF在星形細胞瘤中的陽性表達率為58.33%，明顯高于正常腦組織，并且隨著腫瘤組織病理級別的升高陽性率逐漸上升。這說明VEGF在星形細胞瘤的血管形成中起著重要作用。

總之，本研究結果表明Ang-2及VEGF在星形細胞瘤中發生及惡化過程中起重要作用，可根據其在血管和腫瘤細胞表達的實事，使它作為預測星形細胞瘤預后的標志物在腫瘤血管的分子靶向治療上發揮作用成為可能。

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（收稿日期：2013-11-28 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2013-11-28 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2013-11-28 本文編輯：程 銘）