MGMT基因甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸鋸齒狀病變中的表達及意義

許春偉+王魯平++++葛暢

[摘要] 目的 觀察鋸齒狀病變組織中MGMT基因甲基化狀態(tài)和MGMT蛋白表達，探討臨床病理意義和在癌變通路中的作用，同時探討MGMT基因在不同年齡層段甲基化狀況。 方法 應(yīng)用Taqman探針qPCR（MethyLight）方法檢測北京軍區(qū)總醫(yī)院2007～2013年的225例鋸齒狀病變[包括96例增生性息肉（HP）、61例廣基（無蒂）鋸齒狀腺瘤/息肉（SSA/P）和68例傳統(tǒng)型鋸齒狀腺瘤（TSA）]、54例管狀腺瘤（TA）、69例結(jié)直腸癌（CRC）和42例正常結(jié)直腸黏膜組織中MGMT基因CpG島甲基化狀態(tài)，并通過測序法驗證擴增的目的片段甲基化狀態(tài)，同時應(yīng)用免疫組化方法檢測其中116例鋸齒狀病變（包括52例HP、41例SSA/P、23例TSA）、20例TA、24例CRC和24例正常結(jié)直腸黏膜組織中MGMT蛋白的表達情況。 結(jié)果 MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)和MGMT蛋白異常陽性程度在鋸齒狀病變和對照組中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），且兩者之間呈負相關(guān)；MGMT基因啟動子甲基化頻率在不同年齡層段相關(guān)性比較中兩者呈正相關(guān)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 組織中MGMT基因甲基化可能誘導(dǎo)其蛋白表達下調(diào)的主要原因，在結(jié)直腸“增生性息肉-鋸齒狀腺瘤-癌”的鋸齒狀癌變通路中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] DNA甲基化；MGMT基因；qPCR；DNA探針；鋸齒狀病變

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）01（b）-0011-06

Expression and significance of MGMT gene methylation status in colorectal serrated lesions

XU Chunwei WANG Luping▲ GE Chang

Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To discuss patients with serrated lesions tissues MGMT gene methylation status and MGMT protein expression and cancer pathways and the role and clinical significance of MGMT gene in different age paragraph methylation level. Methods From 2007 to 2013 in the Military General Hospital of Beijing PLA， 225 cases of serrated lesions [96 cases of hyperplastic polyp （HP）， 61 cases of sessile serrated adenoma/polyp （SSA/P） and 68 cases of traditional serrated adenoma （TSA）]， 54 cases of tubular adenoma （TA）， 69 cases of colorectal cancer （CRC） and 42 cases of normal colorectal mucosa tissues were selected； MGMT gene methylation status of CpG island was detected by qPCR applications Taqman probe （MethyLight） methods， methylation state of amplification target fragment was verified by by sequencing method， at the same time， MGMT protein expression in 116 cases of serrated lesions （including 52 cases of HP， 41 cases of SSA/P， 23 cases of TSA）， 20 cases of TA， 24 cases of CRC， 24 cases of normal colorectal mucosa tissue was detected by immunohistochemical method. Results The differences of MGMT gene promoter methylation state and degree of abnormal MGMT protein positive degree in the serrated lesions and the control group were statistically significant （P < 0.05）， the negative correlation was found； the positive correlation was found between frequency of MGMT gene promoter methylation and different age paragraph， but the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion Organization MGMT gene methylation may induce the protein expression in the main reason for the downgrade， it plays an important role in serrated canceration pathway of hyperplastic polyps-serrated adenoma-carcinoma.

[Key words] DNA methylation； MGMT gene； qPCR； DNA probe； Serrated lesions

鋸齒狀病變是一組具有鋸齒狀（波浪狀或星狀）結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性上皮病變，包括增生性息肉（hyperplastic polyp，HP）、廣基（無蒂）鋸齒狀腺瘤/息肉（sessile serrated adenoma/polyp，SSA/P）、傳統(tǒng)型鋸齒狀腺瘤（traditional serrated adenoma，TSA）。新近統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）中60%的來自普通腺瘤，35%來自“增生性息肉-鋸齒狀腺瘤-癌”這條鋸齒狀通路[1]，特別是鋸齒狀病變的CpG島甲基化表型（CpG island methylator phenotyp，CIMP）。鋸齒狀通路涉及一系列異常的表觀遺傳學(xué)修飾[2]。這些異常修飾中以DNA甲基化最常見。DNA異常甲基化分為A型和C型，前者與年齡因素有關(guān)，年齡越大，甲基化頻率越高，后者與腫瘤相關(guān)，通過引起相關(guān)基因表達下調(diào)或沉默，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。

MGMT為DNA損傷修復(fù)基因，定位于人類染色體10q26，全長170 kb，由5個外顯子，4個內(nèi)含子組成。啟動子富含GC堿基，順式作用元件有CpG島中的6個Spl位點、2個糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（GRE），AP-I元件等。cDNA長約769 bp，編碼207個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。MGMT序列具有相對穩(wěn)定性，從結(jié)腸桿菌到哺乳動物均含有結(jié)構(gòu)一致的“-異亮氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-組氨酸-精氨酸-纈氨酸-”（IPCHRV）活性基序列，活性位點在145位半胱氨酸殘基上[4]。本研究通過MethyLight方法，一方面分析鋸齒狀病變中MGMT基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)和免疫組化中MGMT蛋白的表達情況，在基因?qū)用婧偷鞍讓用鎸GMT進行初步探究，另一方面分析鋸齒狀病變中MGMT基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)和年齡相關(guān)因素情況，在甲基化和年齡上對MGMT進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 收集北京軍區(qū)總醫(yī)院2007～2013年病理診斷為各類結(jié)直腸息肉和腺瘤切片4810例，從中篩選出腺體具有鋸齒狀特征的息肉及腺瘤，進行組織學(xué)診斷及分類。由3名病理醫(yī)師按WHO（2010）消化系統(tǒng)腫瘤分類及文獻標準[5-9]4～5輪回顧性閱片。從中篩選出225例鋸齒狀病變（96例HP、61例SSA/P和68例TSA）作為實驗組，并以54例管狀腺瘤（tubular adenoma，TA）、42例正常結(jié)直腸黏膜組織和69例CRC作為對照。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，甲基化修飾試劑盒為美國ZYMO公司產(chǎn)品，核酸蛋白質(zhì)濃度測量儀B-500購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司，甲基化陽性/陰性對照為美國ZYMO公司產(chǎn)品，qPCR反應(yīng)試劑ROX購自TaKaRa公司，Mix購自上海輝睿生物科技有限公司，MGMT抗體購自中杉金橋公司（1∶500稀釋），內(nèi)參基因β-肌動蛋白（β-actin）引物和探針參照文獻[10]設(shè)計，甲基化引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。Mx3000P定量PCR擴增儀為美國Stratagene公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 甲基化引物和探針設(shè)計 MGMT基因序列參照GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），GenBank Accession：NC_000010。甲基化引物和探針由Beacon Designer7.9軟件設(shè)計，設(shè)計標準：引物擴增片段大小在80～150 bp范圍，引物長度17～25 bp，GC含量在40%～70%，兩條引物的Tm值盡量接近。避免引物內(nèi)部或之間形成3 bp以上的互補序列。探針長度20～30 bp，探針的Tm值比引物高5～10℃，探針內(nèi)標或探針與引物之間避免形成3 bp以上的互補序列，對其進行BLAST檢查，引物和探針符合要求，并由上海輝睿生物科技有限公司合成。見表1。

1.2.2 DNA提取 采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取組織DNA，將含有DNA組織的蠟塊連切5張10 μm的厚蠟?zāi)ぃ瑖栏癜凑赵噭┖姓f明步驟進行操作。并測定其純度和濃度備用。

1.2.3 甲基化修飾 采用EZ DNA Methylation-GoldTM Kit（D5005）試劑盒，嚴格按照試劑盒說明步驟進行操作。經(jīng)此步后，DNA序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║）。

1.2.4 MethyLight PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修飾后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探針FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，共50個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃冷卻5 min。每例標本設(shè)兩個復(fù)孔，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作為陽性、陰性對照，水為空白對照。

1.2.5 測序法驗證擴增序列 PCR擴增產(chǎn)物送北京金唯智生物科技有限公司測序，由于擴增序列（94 bp）過小，連接到質(zhì)粒作為載體后，用通用引物的方法測序，結(jié)果如圖1所示，測序目的片段和Beacon Designer 7.9軟件設(shè)計序列吻合。

甲基化片段中CpG二核苷酸的胞嘧啶保持不變

圖1 MGMT基因擴增片段部分測序圖

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 所有標本常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，60℃溫箱烘烤90 min。采用EnVision二步法，實驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行，高溫高壓抗原修復(fù)，DAB顯色，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗為陰性對照，已知陽性的結(jié)腸腺體組織為陽性對照。

1.2.7 結(jié)果判斷標準 MethyLight結(jié)果判斷標準[11]：同時擴增目的基因（MGMT）和內(nèi)參基因（β-actin），根據(jù)標準曲線得到兩者的原始拷貝數(shù)，計算標準甲基化指數(shù)（normalized index of methylation，NIM）其定義為：NIM=[（MGMT sample/MGMT positive）β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中MGMT sample指樣本中甲基化MGMT基因的拷貝數(shù)，MGMT positive指陽性對照中甲基化MGMT基因的拷貝數(shù)，β-actin sample和β-actin positve與上述相同。NIM≥4為甲基化，NIM<4為非甲基化。免疫組化判斷標準[12]：MGMT陽性定位于細胞核；標記指數(shù)計算方法：每張切片低倍鏡下選擇組織結(jié)構(gòu)良好、比較清晰的5個陽性細胞最為密集的區(qū)域，每個區(qū)域在高倍鏡下，計數(shù)100個細胞中的陽性細胞指數(shù)（不包括間質(zhì)細胞和其他非腫瘤細胞），計算陽性細胞數(shù)平均值的百分率。標記指數(shù)計分：Ⅰ級10%～25%為1分，Ⅱ級>25%～50%為2分，Ⅲ級>50%～75%為3分，Ⅳ級>75%～100%為4分。染色強度計分：Ⅰ級淡黃色為1分，Ⅱ級棕黃色為2分，Ⅲ級棕褐色為3分。每張切片兩種評分之乘積為該切片最后的表達強度：0分為（-），1～3分為（+），4～6分為（++），≥7分為（+++）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。甲基化結(jié)果運用χ2及Fisher確切概率法，免疫組化結(jié)果使用多組有序秩和檢驗，兩組間比較運用Bonferroni檢驗，甲基化和蛋白表達相關(guān)性及甲基化和年齡相關(guān)性運用Pearson相關(guān)法進行統(tǒng)計學(xué)處理，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料特征

225例鋸齒狀病變中HP 96例、SSA/P 61例、TSA 68例，分別占鋸齒狀病變的42.67%、27.11%和30.22%，96例HP中，男63例，女33例，男性多見，年齡31～88歲，平均（56.052±12.448）歲；61例SSA/P中，男43例，女18例，男性多見，年齡23～84歲，平均（56.665±14.976）歲；68例TSA中，男46例，女22例，男性多見，年齡30～85歲，平均（59.470±12.506）歲。

2.2 MGMT基因標準曲線分析

將陽性對照按10的倍數(shù)稀釋成1～1×10-6 7個濃度梯度制作標準曲線（其拷貝數(shù)為103～109/mL），各濃度梯度反應(yīng)均做復(fù)孔。MethyLight的線性范圍為104～108拷貝/mL，R2為0.942。

2.3 MGMT基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)

MGMT基因啟動子CpG島甲基化陽性表達率在正常組、TA組、HP組、SSA/P組、TSA組和CRC組分別為0.00%（0/42）、46.30%（25/54）、26.04%（25/96）、60.66%（37/61）、76.47%（52/68）和68.12%（47/69），各組差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 112.790，P = 0.000）。正常組與SSA/P、TSA、TA、CRC組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），HP組與SSA/P、TSA、CRC組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表2、圖2（見封三）。

表2 MGMT基因CpG島甲基化陽性率統(tǒng)計結(jié)果[n（%）]

注：與正常組比較，▲P < 0.05；與HP組比較，△P < 0.05；HP：增生性息肉；TA：管狀腺瘤；SSA/P：廣基（無蒂）鋸齒狀腺瘤/息肉；TSA：傳統(tǒng)型鋸齒狀腺瘤；CRC：結(jié)直腸癌

2.4 MGMT蛋白陽性表達率

MGMT蛋白陽性表達率在正常組、TA組、HP組、SSA/P組、TSA組和CRC組分別為100.00%（24/24）、80.00%（16/20）、98.08%（51/52）、78.05%（32/41）、69.57%（16/23）和70.83%（17/24），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 26.641，P = 0.000）。正常組與HP、SSA/P、TSA、TA、CRC組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），HP組與SSA/P組、TSA組、TA組和CRC組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表3、圖3。

2.5 MGMT基因甲基化與MGMT蛋白相關(guān)性分析

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，TA、SSA/P、TSA、CRC三組中MGMT甲基化與MGMT蛋白表達結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），且相關(guān)性為負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r = -0.500、-0.361、-0.437、-0.412；HP中MGMT甲基化與MGMT蛋白表達結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），但相關(guān)性為負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r = -0.220。見表4。

2.6 MGMT基因甲基化與年齡相關(guān)性分析

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，TA、HP、SSA/P、TSA四組中MGMT基因甲基化與年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。MGMT基因甲基化與年齡相關(guān)性為正相關(guān)，與TA、HP、SSA/P、TSA相關(guān)系數(shù)分別為0.042、0.009、0.087、0.138。見表5。

3 討論

CRC是最常見的惡性消化道腫瘤之一，全球CRC每年新發(fā)病例數(shù)達123萬，死亡約為發(fā)病率的1/2。近年研究表明，CRC發(fā)病率目前仍呈持續(xù)增長態(tài)勢，其原因之一就是對結(jié)直腸鋸齒狀病變認識不足[2，13]。2010年WHO消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類中對鋸齒狀病變的分類比以往更為詳細[9]，HP在鋸齒狀病變中最常見，占所有病變的75%以上，根據(jù)組織學(xué)上的微小差別分為微泡性增生性息肉（microvesicular hyperplastic polyp，MVHP）、富于杯狀細胞的增生性息肉（goblet-cell rich hyperplastic polyp，GCHP）、寡黏液型增生性息肉（mucin-poor type，MPHP）[14]。SSA/P占鋸齒狀病變的15%～25%，根據(jù)細胞異型性分為伴/不伴有細胞異性增生型[14-16]。TSA不常見占鋸齒狀病變的1%左右，特征為具有整體復(fù)雜結(jié)構(gòu)域纖維狀生長方式，常顯示細胞異型特點，與TA及伴細胞異型的SSA不同[14，17]。TSA一般與高MSI癌無關(guān)，可能與低MSI有關(guān)[6]。近年來從分子遺傳學(xué)角度對鋸齒狀病變進行研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸鋸齒狀病變通路是一個多因素、多階段、多基因連續(xù)累積發(fā)生的過程，在此演變過程中有眾多CRC相關(guān)基因參與。鋸齒狀通路分為：①無蒂（廣基）鋸齒通路：以SSA/P和MVHP為代表，癌變機制為BRAF突變，引起錯配修復(fù)基因h-MLH-1甲基化和高水平CpG島甲基化現(xiàn)象，導(dǎo)致腺體不同程度異型性增生直至癌變。②傳統(tǒng)鋸齒狀通路：包括TSA和GCHP，癌變機制為K-RAS基因突變，引起DNA修復(fù)基因MGMT甲基化和低高水平CpG島甲基化現(xiàn)象等。MGMT基因甲基化后，引起一些基因沉默，導(dǎo)致腺體異型性增加，進一步發(fā)展為癌。鋸齒狀通路中有眾多異常基因甲基化，若能深入研究并加以利用，不僅可以用于CRC的早期診斷、高危人群的監(jiān)測、癌變風(fēng)險評估等，還可為CRC靶向治療藥物提供理論依據(jù)支持[1，18]。

在本實驗基因?qū)用嫜芯恐邪l(fā)現(xiàn)正常黏膜組織、TA、HP、SSA/P和TSA中均有MGMT基因啟動子CpG島甲基化，實驗組鋸齒狀病變HP、SSA/P和TSA甲基化率為26.04%（25/96）、60.66%（37/61）和76.47%（52/68），對照組正常黏膜組織、TA和CRC的甲基化率為0.00%（0/42）、46.30%（25/54）和68.12%（47/69）。Dhir等[18]在18例TA中檢測到甲基化率為47.1%，29例不伴異型性的SSA/P中檢測到甲基化率為29.63%，19例伴有異型性的SSA/P中檢測到甲基化率為52.63%，在9例HP中檢測到甲基化率為14.29%，本研究中對照組的TA和實驗組的SSA/P的甲基化率與以上研究結(jié)果基本符合，但實驗組HP的甲基化率明顯高于Dhir等[18]研究，這可能與樣本量、樣本來源、引物在CpG島的位置不同等因素引起系統(tǒng)誤差有關(guān)。本研究對照組與實驗組組間比較過程中，對照組正常黏膜組織與實驗組SSA/P（P = 0.000）和TSA（P = 0.000）有顯著性差異，與實驗組HP（P = 0.230）差異性不顯著；對照組CRC與實驗組HP（P = 0.000），與實驗組SSA/P（P = 0.375）和TSA（P = 0.275）差異性不顯著；對照組TA與實驗組HP（P = 0.012）和TSA（P = 0.001）有顯著性差異，與實驗組SSA/P（P = 0.123）差異性不顯著；實驗組組組間比較過程中，HP和SSA/P（P = 0.000），HP和TSA（P = 0.000）組間有顯著性差異， SSA/P和TSA（P = 0.053）組間差異性不顯著。在本實驗蛋白層面運用免疫組化方法研究中發(fā)現(xiàn)實驗組HP、SSA/P和TSA蛋白表達陽性率為98.08%（51/52）、78.05%（32/41）和69.57%（16/23），對照組正常黏膜組織、TA和CRC中蛋白表達陽性率為100%（24/24）、80.00%（16/20）和70.83%（17/24）。與Sawyer等[19]對39例SA運用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)MGMT陽性表達率為18%（7/39）相比，在本實驗中，SSA/P蛋白陽性表達率[78.05%（32/41）]和TSA蛋白陽性表達率[69.57%（16/23）]明顯高于Sawyer等[9]研究，具體原因可能與甲基化引物設(shè)計、樣本來源、樣本量大小等因素有關(guān)。本研究對照組與實驗組組間比較過程中，對照組正常黏膜組織與實驗組HP（P = 0.001）、SSA/P（P = 0.000）和TSA（P = 0.000）有顯著性差異；對照組CRC與實驗組HP（P = 0.001）有顯著性差異，但SSA/P（P = 0.515）和TSA（P = 1.000）差異性不顯著；對照組TA與實驗組HP（P = 0.029）有顯著性差異，但與實驗組SSA/P（P = 1.000）和TSA（P = 0.434）差異性均不顯著；實驗組與實驗組組間比較過程中，HP和TSA（P = 0.001），HP和SSA/P（P = 0.006）中組間有顯著性差異，但在SSA/P和TSA（P = 0.452）中組間差異性均不顯著。在本實驗MGMT基因甲基化與蛋白表達相關(guān)性研究中，發(fā)現(xiàn)在實驗組HP、SSA/P和TSA中分別呈弱相關(guān)（P = 0.117，r = -0.220）、弱相關(guān)（P = 0.020，r = -0.361）及中等程度相關(guān)（P = 0.037，r = -0.437），對照組正常黏膜組織、TA和CRC中，正常黏膜組織運用Pearson法無法計算相關(guān)性，TA中呈中等程度相關(guān)（P = 0.025，r = -0.500），CRC中呈中等程度相關(guān)（P = 0.046，r = -0.412）。通過數(shù)據(jù)可以看出，在實驗組中HP、SSA/P和TSA基因甲基化和蛋白表達有顯著性差異，相關(guān)性分別為弱相關(guān)、弱相關(guān)和中等程度相關(guān)；在對照組中TA和CRC基因甲基化和蛋白表達有顯著性差異，相關(guān)性都為中等程度相關(guān)。通過基因?qū)用婧偷鞍讓用婕皟烧呦嚓P(guān)性的探究，推測在鋸齒狀病變通路中MGMT基因啟動子甲基化有誘導(dǎo)MGMT蛋白表達下調(diào)，在鋸齒狀通路的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在年齡相關(guān)性甲基化研究方面，在基因目的序列（-107～-200）這部分的位點上實驗組HP（P = 0.931，r = 0.009）、SSA/P（P = 0.763，r = 0.042）和TSA（P = 0.263，r = 0.138）及對照組TA（P = 0.763，r = 0.042）中差異性均不顯著（P > 0.05），且相關(guān)性為弱正相關(guān)。

綜上所述，MGMT基因啟動子CpG島甲基化可能導(dǎo)致MGMT蛋白表達下調(diào)，與鋸齒狀病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在無蒂（廣基）鋸齒通路和傳統(tǒng)鋸齒狀通路中起重要推動作用，是CRC發(fā)生重要的分子事件。

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[8] 王魯平，楊光之，周志勇，等.結(jié)直腸鋸齒狀病變104例形態(tài)學(xué)及細胞增殖活性的觀察[J].中華病理學(xué)雜志，2009， 38（2）：100-105.

[9] Hamilton SR，Bosman FT，Boffetta P. Carcinoma of the colon and rectum. WHO Classification of Tumors of the Digestive System. Pathology and Genetics Tumours and Digestive System [M]// 4th edition，Switzerland：WHO press，2010：134-146，160-165.

[10] Ogino S，Kawasaki T，Brahmandam M，et al. Precision and performance characteristics of bisulfite conversion and real-time PCR（MethyLight）for quantitative DNA methylation analysis [J]. J Mol Diagn，2006，8（2）：209-217.

[11] Eads CA，Lord RV，Kurumboor SK，et al. Fields of aberrant CpG island hypermethylation in Barrett's esophagus and associated adenocarcinoma [J]. Cancer Res，2000，60（18）：5021-5026.

[12] 許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標準[J].中國癌癥雜志，1996，（4）：229-231.

[13] 趙娜，楊廷翰，郝晉，等.高風(fēng)險結(jié)直腸癌患者快速流程模式的臨床應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代普通外科進展，2011，14（4）：269-272.

[14] Torlakovic E，Skovlund E，Snover DC，et al. Morphologic reappraisal of serrated colorectal polyps [J]. Am J Surg Pathol，2003，27（1）：65-81.

[15] Goldstein NS，Bhanot P，Odish E，et al. Hyperplastic-like colon polyps that preceded microsatellite-unstable adenocarcinomas [J]. Am J Clin Pathol，2003，119（6）：778-796.

[16] Spring KJ，Zhao ZZ，Karamatic R，et al. High prevalence of sessile serrated adenomas with BRAF mutations：a prospective study of patients undergoing colonoscopy [J]. Gastroenterology，2006，131（5）：1400-1407.

[17] Snover DC，Jass JR，F(xiàn)enoglio-Preiser C，et al. Serrated polyps of the large intestine：a morphologic and molecular review of an evolving concept [J]. Am J Clin Pathol，2005，124（3）：380-391.

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[19] Sawyer EJ，Cerar A，Hanby AM，et al. Molecular characteristics of serrated adenomas of the colorectum [J]. Gut，2002，51（2）：200-206.

（收稿日期：2013-11-14 本文編輯：李繼翔）

[5] Torlakovic EE，Gomez JD，Driman DK，et al. Sessile serrated adenoma（SSA）vs. traditional serrated adenoma（TSA）[J]. Am J Surg Pathol，2008，32（1）：21-29.

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（收稿日期：2013-11-14 本文編輯：李繼翔）

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[16] Spring KJ，Zhao ZZ，Karamatic R，et al. High prevalence of sessile serrated adenomas with BRAF mutations：a prospective study of patients undergoing colonoscopy [J]. Gastroenterology，2006，131（5）：1400-1407.

[17] Snover DC，Jass JR，F(xiàn)enoglio-Preiser C，et al. Serrated polyps of the large intestine：a morphologic and molecular review of an evolving concept [J]. Am J Clin Pathol，2005，124（3）：380-391.

[18] Dhir M，Yachida S，Neste L，et al. Sessile serrated adenomas and classical adenomas：an epigenetic perspective on premalignant neoplastic lesions of the gastrointestinal tract [J]. Int J Cancer，2011，129（8）：1889-1898.

[19] Sawyer EJ，Cerar A，Hanby AM，et al. Molecular characteristics of serrated adenomas of the colorectum [J]. Gut，2002，51（2）：200-206.

（收稿日期：2013-11-14 本文編輯：李繼翔）