Nisin和檸檬酸對純培養及鮮切黃瓜中單增李斯特菌的殺菌效果

陳 晨，胡文忠，何煜波，姜愛麗，薩仁高娃

(大連民族學院生命科學學院, 生物化學工程國家民委-教育部重點實驗室, 遼寧省食源性病原微生物快速檢測與控制工程技術研究中心, 遼寧 大連 116600)

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種常見的人畜共患病食源性革蘭氏陽性致病菌[1]，在自然界中廣泛存在[2]，可以通過污染畜禽產品、蔬菜、水果等食物而引起人類感染致病[3-4]。近年來，由LM引起的食品中毒事件時有發生，且引起了人員死亡[5,6]。因此，對LM控制措施成為食品安全領域的研究熱點。乳酸鏈球菌素(nisin)是由某些乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)產生的安全且具有高效殺菌作用的多肽，目前許多國家允許其商業化生產作為食品防腐劑使用[7]，我國于1990 年由衛生部食品監督廳簽發了在國內應用 Nisin 作為食品保藏劑的使用合格證明書[8]。有機酸能降低環境 pH 值，破壞細菌細胞壁運輸系統和滲透壓，擾亂微生物的內穩態，從而抑制微生物生長繁殖，檸檬酸等有機酸常用于控制鮮切果蔬微生物的生長和防止褐變[9-11]。現階段研究利用nisin和檸檬酸來控制鮮切果蔬中LM的研究較多[12-15]，但同時對比研究nisin、檸檬酸以及二者復配對純培養LM及接種到鮮切黃瓜的LM的殺菌效果未有報道。本文比較研究了不同濃度的nisin、檸檬酸以及二者復配對純培養LM，以及人工接種到鮮切黃瓜上的LM處理不同時間后的殺菌效果，為探究鮮切果蔬的貯藏保鮮技術提供新的方法和思路。

1.材料方法

1.1 材料與儀器

黃瓜 購于大連開發區樂購超市；菌株 LM標準菌株（ATCC19115）來自遼寧省疾病控制中心；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）、牛津瓊脂（OXA）基礎、牛津瓊脂（OXA）添加劑 青島海博生物技術有限公司；蛋白胨 北京陸橋技術有限責任公司；乳酸鏈球菌素（nisin） 浙江銀象生物工程有限公司；檸檬酸：食品級、95%乙醇、無水乙醇等化學試劑為分析純。

MLS-3020 型全自動高壓蒸汽滅菌器日本 SANYO公司；1300系列 A2型二級生物安全柜 美國THERMO FISHER SCIENTIFIC公司；AB135-S型分析天平 瑞士 METTLER TOLEDO公司；BagM ixer-400W型均質器 法國INTERSCIENCE公司；DNP-9052型電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；HYC-326A型醫用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司；YLE-1000型電熱恒溫水浴鍋 北京東方精瑞科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原菌液的制備 在無菌室的生物安全柜內無菌操作取標準LM菌株，在TSA-YE無菌平板上平行劃線活化，36℃培養24～48h后挑取單菌落接種到含有150m L無菌TSB-YE的三角瓶中，充分混勻，將三角瓶放入36℃培養箱中，培養24～48h至初始菌落數大致為107cfu/m L，即原菌液，4℃保存，備用。

1.2.2 接種菌液的制備 原菌液在4℃、5000rpm條件下離心5min后，棄去上清，沉淀用0.1%蛋白胨水沖洗，重復兩次，得到濃度約為107cfu/m L的菌懸液，即接種菌液，4℃保存，備用。

1.2.3 樣品制備 在無菌室內，將新鮮黃瓜用自來水洗凈，用無菌刀將鮮切黃瓜切成約1cm×1cm×1cm的小塊，每20g一份置于一個無菌容器中。每份鮮切黃瓜樣品接種0.1 m L接種菌液，充分混勻，使樣品的初始菌數大致為104～105cfu/g。接種后，樣品在生物安全柜中干燥1h。

1.2.4 nisin和檸檬酸對純培養LM的處理 在無菌室的生物安全柜里以無菌操作將充分混勻的原菌液梯度稀釋約為105cfu/m L，即純培養原菌液。取0.5mL純培養原菌液分別加入含有4.5m L不同濃度 nisin（10、50、100μg/m L）和檸檬酸（0.1%、0.3%、0.5%）以及二者復配液(10μg/m L+0.1%、10μg/m L+0.3%、50μg/m L+0.1%、50μg/m L+0.3%)的試管中，充分混合振蕩不同時間（5、10、15、20 min）后，從中吸取 0.5m L加入到 4.5m l 無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取 100μL 的稀釋液涂布于牛津瓊脂（OXA）平板上，36℃培養48h后計數[1]。每個處理做2個平行實驗。

1.2.5 nisin和檸檬酸對接種LM樣品的處理 在無菌室內的生物安全柜里，分別把接種LM的鮮切黃瓜放入含100m L nisin和檸檬酸以及二者復配溶液的無菌燒杯中，攪拌浸泡不同時間（5min、10min、15min、20min），取出容器中的樣品置于無菌均質袋中，加入50mL滅菌的0.1%蛋白胨水，在拍擊式均質機上連續均質 1min，取上清菌懸液選擇合適稀釋度用無菌生理鹽水進行稀釋，取 100μL 的稀釋液涂布于牛津瓊脂（OXA）平板上，36℃培養48h后計數。每個處理做2個平行實驗。

1.3 統計分析

采用 SPSS17.0進行方差分析，用Origin8.0作圖.

2.結果與分析

2.1 Nisin對純培養和鮮切黃瓜LM殺菌效果的比較

圖1.不同濃度nisin對純培養（a）和鮮切黃瓜（b）LM的殺菌效果Fig.1 Disinfection effect of nisin for inactivation of LM in pure culture (a) and on fresh-cut cucumbers (b).

自來水以及不同濃度nisin對純培養和鮮切黃瓜處理不同時間后殘留LM的檢測結果如圖1a和圖1b所示，采用自來水清洗鮮切黃瓜后，鮮切黃瓜和純培養體系中的 LM 均有所降低，但降幅僅為 0.2～0.4 log cfu/g，說明自來水的殺菌作用十分微弱，單純采用自來水清洗無法有效控制病原微生物的生長，只有加入高效的殺菌劑才能夠保證鮮切果蔬的質量安全[14]。當清洗用水中加入nisin后，隨著nisin濃度的增加及作用時間的延長其對LM的殺菌效果逐漸增強（p<0.05），并且對兩種介質中LM的殺菌效果存在一定差異。當nisin濃度小于50μg/m L時，純培養和鮮切黃瓜LM的減少量相當，分別為0.1～1.1 log cfu/m L（純培養）和0.2～1.1 log cfu/g（鮮切黃瓜），當nisin濃度增加到100μg/mL時，作用5min后使純培養體系中的LM降低到檢測限以下，而對鮮切黃瓜處理15min后才使LM低于檢測限。

2.2 檸檬酸對純培養和鮮切黃瓜LM殺菌效果的比較

圖2.不同濃度檸檬酸對純培養（a）和鮮切黃瓜（b）LM的殺菌效果Fig.2 Disinfection effect of citric acid for inactivation of LM in pure culture (a) and on fresh-cut cucumbers (b).

圖2a和圖2b分別表示不同濃度檸檬酸對純培養和鮮切黃瓜LM處理不同時間后的殺菌效果，如圖2所示，檸檬酸對LM的殺菌效果也是隨著濃度的增加和作用時間的延長而增強（p<0.05）。當檸檬酸濃度較低時對兩種體系中LM的殺菌作用無顯著差異（p>0.05），當檸檬酸濃度增加到0.5%時，處理10min可以使純培養中的LM降低到檢測限以下，而此時對鮮切黃瓜LM的殺菌對數值僅為1.6 log (cfu/g)，但當其處理15min后，則可使鮮切黃瓜的LM降低到檢測限以下。這一研究結果與2.1中 nisin對純培養和鮮切黃瓜LM殺菌效果一致。分析原因可能是采用nisin或檸檬酸清洗接種后的鮮切黃瓜時攪動不夠充分，LM無法與殺菌劑充分接觸[16]；也可能是接種到鮮切黃瓜表面的LM進入到了黃瓜組織內部[17]，清洗時殺菌劑需要足夠的時間進入黃瓜組織內部殺死LM。

2.3 Nisin和檸檬酸復配對純培養和鮮切黃瓜LM殺菌效果的比較

Nisin和檸檬酸復配對純培養和鮮切黃瓜LM殺菌效果如圖3所示，總體來看，nisin和檸檬酸復配的殺菌效果要優于二者單獨使用（p<0.05）。當nisin和檸檬酸復配濃度為 10μg/m L+0.1%，50μg/m L+0.1%以及10μg/m L+0.3%時，對純培養體系中LM的殺菌效果高于對鮮切黃瓜中LM的殺菌效果。當二者復配濃度增加到50μg/m L+0.3%時，處理20min后可以使純培養體系中的LM達到檢測限以下；而鮮切黃瓜中的LM僅需15min就可以降低到檢測限以下。由此可見，nisin和檸檬酸的復配使二者間產生了協同效應，增強了對LM 的殺菌效果。Xu等人研究表明單獨使用 nisin沒有使鮮切黃瓜和鮮切萵苣中 LM 的數量顯著降低（p>0.05），當nisin與檸檬酸和葡萄籽提取物聯合使用后，可顯著降低LM的數量（p<0.05）[15]。石玉新等人研究表明nisin和檸檬酸聯合使用對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌的抑菌效果要明顯優于檸檬酸單獨使用[18]。相對于對純培養體系中LM 的殺菌效果，濃度越高的檸檬酸和nisin的復配對鮮切黃瓜中的LM作用效果越強，這可能是由于高濃度的檸檬酸有助于增強nisin在鮮切黃瓜組織中的通透性，提高了nisin與LM的有效作用時間。

圖3.Nisin和檸檬酸復配對純培養（a）和鮮切黃瓜（b）的殺菌效果Fig.3 Disinfection effect of nisin combination w ith citric acid for inactivation of LM in pure culture (a) and on fresh-cut cucumbers (b)

3.結論

不同濃度的 nisin和檸檬酸及二者復配對純培養以及接種到鮮切黃瓜上的單增李斯特菌均具有一定的殺菌作用，殺菌效果隨著濃度的增加以及作用的時間延長而增強，且nisin和檸檬酸復配殺菌效果要優于二者的單獨使用。100μg/m L nisin和0.5%檸檬酸單獨使用可使純培養和鮮切黃瓜中的單增李斯特菌降低到檢測限以下，當二者聯合使用時，50μg/m L nisin+0.3%檸檬酸即可使兩種介質中的單增李斯特菌降低至檢測限以下。

通過比較nisin和檸檬酸及二者復配對兩種介質中單增李斯特菌的殺菌效果發現，當nisin和檸檬酸濃度較低時，純培養及鮮切黃瓜中單增李斯特菌的減少量無明顯差異，當濃度較高時，5-10min內即可將純培養體系中的單增李斯特菌降低到檢測限以下，而對于鮮切黃瓜則需要15min；當nisin和檸檬酸二者復配濃度為50μg/m L+0.3%時，使鮮切黃瓜中單增李斯特菌降低到檢測限以下需要15min，殺菌時間略短于純培養體系（20min），在試驗選用的其余三組復配濃度條件下，純培養體系中單增李斯特菌的減少量要高于鮮切黃瓜中單增李斯特菌的減少量。

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