茶樹(shù)花萃取物的降血脂及抗氧化性能研究*

王娟，余銳，黃惠華

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州，510641）

茶樹(shù)花是茶樹(shù)（Camellia sinensis）開(kāi)出的花朵，含有豐富的蛋白質(zhì)、茶多糖、氨基酸、維生素等多種有益成分和活性物質(zhì)，對(duì)人體具有解毒、降脂、降糖、抗癌、滋補(bǔ)、養(yǎng)顏等功效[1-2]。利用超臨界CO2萃取所得的茶樹(shù)花浸膏，使茶樹(shù)花中部分茶多酚、茶多糖、咖啡因和黃酮類(lèi)等活性物質(zhì)殘留在萃取后的茶樹(shù)花渣中[3-4]，從而使茶樹(shù)花渣有一定的生理活性，目前已有研究表明茶葉具有降血脂和抗氧化的功效[5], 但對(duì)茶樹(shù)花的相關(guān)功效研究室鮮有報(bào)道，因此，本文研究茶樹(shù)花的超臨界萃取物以及茶樹(shù)花渣萃取物的降血脂及抗氧化活性，為茶葉種植的副產(chǎn)物——茶樹(shù)花的綜合利用提供參考。

本文通過(guò)測(cè)定茶樹(shù)花浸膏和茶樹(shù)花渣乙醇萃取物與膽酸鹽的結(jié)合能力來(lái)初步研究其降血脂能力；通過(guò)比較茶樹(shù)花浸膏、茶樹(shù)花渣乙醇萃取物與傳統(tǒng)抗氧化劑2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）對(duì)DPPH自由基（DPPH·）、超氧陰離子（O·）和羥自由基（·OH）的清除能力來(lái)研究其抗氧化能力。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

干茶樹(shù)花，英紅1號(hào)，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶園；?；悄懰徕c(STC) 美國(guó)Sigma公司；甘氨膽酸鈉(SGC)日本TCI公司；BHT 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH 美國(guó)Johnson Matthey公司。

UV-1800 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司；HL-（1L+5L）/50MPa-IIB型超臨界萃取裝置 杭州華黎泵業(yè)有限公司。

1.2 茶樹(shù)花萃取物的制備

1.2.1 茶樹(shù)花浸膏 將干茶樹(shù)花粉碎過(guò)篩后放入萃取釜中進(jìn)行超臨界CO2萃取得茶樹(shù)花浸膏，具體工藝參數(shù)為：壓力35MPa，溫度：48℃，夾帶劑95%乙醇添加量(w/w)：43%，萃取時(shí)間120min[4]。

1.2.2 茶樹(shù)花渣乙醇萃取物 將經(jīng)超臨界CO2萃取后的茶樹(shù)花渣烘干粉碎過(guò)10目篩，稱(chēng)取一定量于三口燒瓶中，加入95%乙醇，于80℃下攪拌回流萃取2h，萃取兩次，第二次的萃取時(shí)間為1h。合并兩次的萃取液，4℃冷藏24h，趁冷過(guò)濾除雜，50℃真空濃縮至近干后真空干燥，得到茶樹(shù)花渣乙醇萃取物。

1.2.3 試驗(yàn)樣品溶液的配制 將茶樹(shù)花浸膏和茶樹(shù)花渣乙醇萃取物分別溶于無(wú)水乙醇中，分別依次配制成32、 16、8、4、2、1mg/m L的梯度溶液。

1.3 降血脂實(shí)驗(yàn)

肝臟中膽汁酸主要以與鹽結(jié)合的形式存在，并主要與甘氨酸和?；悄懰峤Y(jié)合形成甘氨酸膽酸鈉（SGC）或牛磺膽酸鈉（STC），因此可通過(guò)測(cè)定樣品對(duì)膽酸鹽的吸附能力來(lái)表征其降血脂能力[5-6]。

分別移取待測(cè)樣品的不同濃度溶液各1mL于10m L具塞試管中，加入4m L膽酸鹽溶液（STC、SGC的0.3mmol/L，pH6.3的0.1mol/L磷酸緩沖液配制），在37℃分別恒溫振蕩1h，混合物轉(zhuǎn)入離心管，4000r/min離心20min，取上清液2.5m L于10m L具塞試管中，再加入7.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的硫酸溶液，于70℃水浴20min,取出冰浴5min，在387nm處測(cè)定吸光度，樣品對(duì)膽酸鹽的吸附率按以下公式計(jì)算：

式中：A0-4m L膽酸鹽的磷酸緩沖溶液＋1m L無(wú)水乙醇的吸光度；A1-4mL膽酸鹽的磷酸緩沖溶液＋1m L樣品乙醇溶液的吸光度；A2-4m L磷酸緩沖溶液＋1m L樣品乙醇溶液的吸光度。

1.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.4.1 清除DPPH·的實(shí)驗(yàn)方法 試管內(nèi)加入2.5m L、6.5×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，然后加入0.5m L待測(cè)樣品溶液，搖勻，室溫下避光放置20min后測(cè)定混合溶液在517nm處的吸光度，清除率按以下公式計(jì)算[3]：

式中：A0為2.5mL DPPH溶液＋0.5m L無(wú)水乙醇的吸光度；A1為DPPH溶液2.5m L＋0.5m L樣品溶液的吸光度；A2為2.5m L無(wú)水乙醇＋0.5m L樣品溶液的吸光度。

式中：A0為0.2m L鄰苯三酚鹽酸溶液+0.3m L無(wú)水乙醇+2.5m LTris-HCl緩沖溶液的吸光值；A1為0.2mL鄰苯三酚鹽酸溶液+0.3m L樣品乙醇溶液+2.5m LTris-HCl緩沖溶液的吸光值；A2為0.2mL鹽酸溶液+0.3m L樣品乙醇溶液+2.5m LTris-HCl緩沖溶液的吸光值。

1.4.3 鄰二氮菲-Fe2+清除·OH的實(shí)驗(yàn)方法 取 1m L、5mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液于試管中，依次加入2m L、pH7.4的0.2mol/L磷酸緩沖溶液和1m L樣品溶液的溶劑，充分混勻后，加入1m L、5mmol/L硫酸亞鐵溶液(FeSO4)，混勻后，加入1m L、0.1%雙氧水(H2O2)，于37℃水浴60min后，在536nm測(cè)其吸光值，即損傷管的吸光值A(chǔ)1。未損傷管以1m L蒸餾水代替損傷管中1m l 0.1%的雙氧水，樣品管以1m L樣品溶液代替損傷管中的1m L樣液的溶劑，其他同損傷管，測(cè)得未損傷管的吸光值A(chǔ)0及樣品管的吸光值A(chǔ)2，清除率按以下公式計(jì)算[3]：

2.結(jié)果與分析

2.1 樣品吸附膽酸鹽實(shí)驗(yàn)

表1 樣品對(duì)兩種膽酸鹽的吸附率Table1 Adsorption rate of Samples to two bile salts

表2 樣品濃度與膽酸鹽吸附率的方程擬合Table2 Fitting equation for sample concentration and adsorption rate of bile salts

從吸附膽酸鹽的類(lèi)型來(lái)看（表1），在濃度為1～2mg/m L的范圍，茶樹(shù)花浸膏結(jié)合SGC的能力都強(qiáng)于結(jié)合STC；茶樹(shù)花渣乙醇萃取物在濃度為1mg/m L時(shí)，結(jié)合SGC的能力強(qiáng)于結(jié)合STC。在2mg/m L的以上濃度，兩種樣品吸附STC的能力強(qiáng)于吸附SGC。在茶樹(shù)花浸膏濃度達(dá)到8mg/m L時(shí)，對(duì)兩種膽酸鹽的吸附率明顯升高，這表明樣品對(duì)膽酸鹽的吸附率可能與樣品中所含有的具有吸附活性的成分的濃度有關(guān)。

由表2可見(jiàn)，在1～32mg/m L的濃度范圍，茶樹(shù)花浸膏對(duì)膽酸鹽的吸附率與其濃度方程擬合度較高，通過(guò)樣品濃度為5mg/m L時(shí)的吸附率Y5比較，茶樹(shù)花浸膏對(duì)STC和SGC兩種膽酸鹽的吸附能力差異不大。茶樹(shù)花渣乙醇萃取物在2～32mg/m L的濃度范圍，其濃度與膽酸鹽的吸附率擬合度較高，而且其對(duì)STC的吸附能力強(qiáng)于對(duì)SGC的吸附。此外，通過(guò)吸附率Y5的比較可以看出，茶樹(shù)花渣乙醇萃取物對(duì)兩種膽酸鹽的吸附能力與考來(lái)烯胺的更加接近，而茶樹(shù)花浸膏對(duì)兩種膽酸鹽的吸附能力較差。

2.2 樣品抗氧化性能

2.2.1 清除DPPH自由基能力

圖1 茶樹(shù)花浸膏、茶樹(shù)花渣乙醇萃取物和BHT清除DPPH·比較Fig.1 DPPH· scavenging rate of tea flower extract, ethanol extracts from tea flower residue and BHT

表3 樣品濃度與DPPH·清除率的擬合方程Table3 Fitting equation of sample concentration and DPPH· scavenging rate

從圖1和表3可以看出，兩種樣品和對(duì)比物BHT隨著濃度的增加對(duì)DPPH·的清除率也隨之增加，其中BHT的清除率增加不明顯，在濃度為1～8mg/m L的范圍，BHT對(duì)DPPH·的清除率就達(dá)到了80%，茶樹(shù)花渣乙醇萃取物在濃度為8mg/m L時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率也達(dá)到了80%，隨著濃度的增加，茶樹(shù)花浸膏對(duì)DPPH·的清除率從3.21%增加到72.43%，兩種樣品和對(duì)比物BHT對(duì)DPPH·的清除率從大到小的順序依次為BHT＞茶樹(shù)花渣乙醇萃取物＞茶樹(shù)花浸膏，這在擬合方程的IC50中也得到了驗(yàn)證，以IC50值衡量，茶樹(shù)花渣乙醇萃取物對(duì)DPPH·清除能力為茶樹(shù)花浸膏的52.2倍。

圖2 茶樹(shù)花浸膏、茶樹(shù)花渣乙醇萃取物和BHT清除O·比較Fig.2 O· scavenging activities of tea flower extract, ethanol extract from tea flower residue and BHT

表4 樣品濃度與O·清除率的擬合方程Table4 Fitting equation of sample concentration and O· scavenging rate

表4 樣品濃度與O·清除率的擬合方程Table4 Fitting equation of sample concentration and O· scavenging rate

樣品 樣品濃度-清除率的擬合方程 R2 IC50(mg/m L)茶樹(shù)花浸膏 y= 19.277ln(x)- 5.810 0.9654 18.084茶樹(shù)花渣乙醇萃取物 y= 14.575ln(x) +34.671 0.9524 2.863 BHT y= 13.631ln(x) +27.949 0.9781 5.043

從圖2和表4可以看出，兩種樣品和對(duì)比物BHT隨著濃度的增加對(duì)O·的清除率也隨之增加，在濃度為1～16mg/m L的范圍，兩種樣品和對(duì)比物BHT對(duì)O·的清除率增加幅度較大，在濃度大于16mg/m L的范圍，茶樹(shù)花渣乙醇萃取物和BHT對(duì)O·的清除率幾乎沒(méi)有增加，而茶樹(shù)花浸膏對(duì)O·的清除率在此范圍從50.51%增加到62.42%，有較大增加。兩種樣品和對(duì)比物BHT對(duì)O·的清除率從大到小的順序依次為茶樹(shù)花渣乙醇萃取物＞BHT＞茶樹(shù)花浸膏，這在擬合方程的IC50中也得到了驗(yàn)證，以IC50值衡量，茶樹(shù)花浸膏對(duì)O·清除能力是BHT的27.8%，而茶樹(shù)花渣乙醇萃取物對(duì)O·清除能力為BHT的1.76倍。

2.2.3 鄰二氮菲-Fe2+清除·OH

圖3 茶樹(shù)花浸膏、茶樹(shù)花渣乙醇萃取物和BHT清除·OH比較Fig.3 ·OH scavenging activities of tea flower extract, ethanol extract from tea flower residue and BHT

表5 樣品濃度與·OH清除率的擬合方程Table5 Fitting equation of sample concentration and ·OH scavenging rate

茶樹(shù)花渣乙醇萃取物 y= 14.492ln(x) +40.147 0.9743 1.974 BHT y= 15.569ln(x) +30.091 0.9864 3.593

從圖3和表5可以看出，兩種樣品和對(duì)比物BHT隨著濃度的增加對(duì)·OH的清除率也隨之增加，在濃度為1～16mg/m L的范圍，兩種樣品和對(duì)比物BHT對(duì)·OH的清除率增加幅度較大，在濃度大于16mg/m L的范圍，茶樹(shù)花渣乙醇萃取物和BHT對(duì)·OH的清除率幾乎沒(méi)有增加，而茶樹(shù)花浸膏對(duì)·OH的清除率在此范圍從59.53%增加到70.43%，有較大增加。兩種樣品和對(duì)比物BHT對(duì)·OH的清除率從大到小的順序依次為茶樹(shù)花渣乙醇萃取物＞BHT＞茶樹(shù)花浸膏，這在擬合方程的IC50中也得到了驗(yàn)證，以茶樹(shù)花浸膏的IC50值衡量，茶樹(shù)花浸膏對(duì)·OH清除能力為BHT的28.5%，而茶樹(shù)花渣乙醇萃取物對(duì)·OH清除能力為BHT的1.82倍。

3.結(jié)論

（1）吸附膽酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：茶樹(shù)花渣乙醇萃取物對(duì)膽酸鹽的吸附能力強(qiáng)于茶樹(shù)花浸膏，尤其在濃度為 1～8mg/m L的范圍。茶樹(shù)花渣乙醇萃取物對(duì)兩種膽酸鹽的吸附能力更接近于考來(lái)烯胺對(duì)兩種膽酸鹽的吸附能力。茶樹(shù)花浸膏對(duì)膽酸鹽的吸附能力較弱，但在濃度大于 8mg/m L時(shí)，茶樹(shù)花浸膏對(duì)膽酸鹽的吸附能力大大增強(qiáng)。這可能是由于不同極性溶劑和萃取方法所得樣品的組分有所差異，組分中茶多酚和咖啡堿含量的差異可能對(duì)樣品的降血脂能力有影響。

（2）抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三種樣品對(duì)DPPH·的清除率從大到小的順序?yàn)椋築HT＞茶樹(shù)花渣乙醇萃取物＞茶樹(shù)花浸膏。對(duì)O·和·OH的清除率能力排序?yàn)椋翰铇?shù)花渣乙醇萃取物＞BHT＞茶樹(shù)花浸膏。根據(jù)樣品濃度與自由基清除率的擬合方程，以IC50值衡量，茶樹(shù)花渣乙醇萃取物對(duì)DPPH·清除能力約為茶樹(shù)花浸膏的52.2倍；茶樹(shù)花浸膏對(duì)O·清除能力為BHT的27.8%，而茶樹(shù)花渣乙醇萃取物對(duì)O·清除能力為BHT的176.1%，茶樹(shù)花浸膏對(duì)·OH清除能力為BHT的28.5%，而茶樹(shù)花渣乙醇萃取物對(duì)·OH清除能力為BHT的182.0%。這可能是由于兩種樣品的組分差異使其對(duì)DPPH·、O和·OH的清除能力有顯著差異。

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