山奈酚清除DPPH自由基的新型微量光度滴定方法研究

劉 萍，高云濤*，張麗珠，張宏教，虞姣姣，茶家偉

（1.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明 650500；2.云南民族大學民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南昆明 650500）

人體的許多疾病與衰老都與自由基氧化損傷有關[1]，從天然物質中尋找高效低毒的抗氧化活性物質受到廣泛的關注，自由基的發生與檢測是抗氧化活性評估的關鍵，目前用于評估天然抗物抗氧化活性的自由基的發生體系包括羥自由基Feton體系、超氧自由基鄰苯三酚自氧化體系、超氧自由基電化學發生體系和人工合成的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基等[2-3]，檢測方法有分光光度法、電化學檢測法、高效液相色譜質譜法（HPLC）、氣質聯用法、化學發光法（CL）和電子順磁共振（EPR，或ESR）[4-9]等，DPPH自由基是種很穩定的氮中心的自由基，其反應變色敏銳，且濃度與吸光度線性關系好，適合分光光度檢測，具有操作快速、準確且穩定可靠等特點，廣泛應用于評價天然物質抗氧化活性中[10-14]。但常規分光光度檢測樣品消耗量大，方法的準確性尚未有文獻系統的研究，不適合天然產物研究中的微量成分研究。在天然產物分離中，很多時候所獲得活性成分通常少于1mg，因此，發展活性成分抗氧化活性微量化檢測方法具有重要價值。酶標儀-微孔板方法目前報道的主要微量化方法，王麗等[15-16]研究了蘆丁清除DPPH·的酶標儀-微孔板微量篩選模型，能快速、準確地對微量天然產物單體化合物的抗氧化性進行篩選。本實驗室李曉芬等[17]提出一種植物多酚清除 DPPH自由活性的微量電化學滴定方法，提出了以植物多酚與 DPPH自由反應的化學計量關系評價其抗氧化活性的新思路。但目前抗氧化活性的微量化檢測方法仍然有限，且上述方法需要專門的儀器，不易普及。

本文基于光度滴定方法原理，以山奈酚[18]為研究對象，提出一種新型活性成分清除DPPH·的微量光度滴定法，方法結合了分光光度法靈敏度高及滴定分析準確好的優點，以微量進樣器在DPPH溶液中滴加活性成分，記錄滴定過程中DPPH·的吸光度變化，確定活性成分與DPPH·反應的化學計量關系，以此評價活性成分清除DPPH·的能力，并通過與常規DPPH·清除檢測方法進行了對照方法驗證。研究表明，本文提出的 DPPH·清除活性的微量光度滴定法樣品使用量明顯下降，具有準確性好、簡單、易于普及、成本低等特點，應用前景較好，為抗氧化活性的微量化檢測提出了一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8453型UV-Vis分光光度計 美國安捷倫公司；7200 型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；10mm和30mm比色皿 宜興市曄輝玻璃儀器廠；AS3120A超聲清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；AL204電子天平 鄭州南北儀器有限公司；10μ微量進樣器 上海高鴿（±0.1μL）。

DPPH（1,1-di-phenyl-2-picryhydrazyl，純度＞99%） 購于美國 Sigma公司，以乙醇溶解，配制為2.54×10-4mol·L-1（0.1mg·m L-1），于4℃儲存，48 h內使用，使用時用乙醇稀釋為所需濃度；山奈酚標準品 購于國藥集團浙江華東醫藥有限公司，純度＞98%，使用時以乙醇溶解，配制為3.49×10-4mol·L-1（0.1mg·m L-1），于4℃儲存；無水乙醇 天津市風船化學試劑科技有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 微量光度滴定法

微量光度滴定法使用可見分光光度計，30cm比色皿以獲得較大測定體積，減少相對誤差。配制不同濃度的DPPH標準溶液系列，于30mm的比色皿中，測定DPPH溶液在517nm處的吸光度值，計算濃度與吸光度關系回歸方程。經測定，本文吸光度與DPPH溶液濃度的關系回歸方程為：A=0.0892cD+0.0056（r=0.9994），式中，A為吸光度，cD為DPPH溶液濃度。

另取一定濃度的DPPH溶液至30mm的石英比色皿中，用微量進樣器以每次10μL逐漸滴加一定濃度山奈酚溶液，混勻，蓋上比色皿蓋，待反應3min后，記錄滴加山奈酚后DPPH溶液在517nm處的吸光度值，繪制山奈酚加入量與DPPH溶液吸光度變化的測定曲線，根據吸光度與DPPH溶液濃度的關系計算溶液中剩余DPPH溶液濃度（c1），結合根據DPPH溶液初始濃度（c0）計算與山奈酚反應的DPPH·物質的量：nD（mol）=（c0- c1）V，V為溶液體積（m L），繪制山奈酚累積加入量nK（mol）與所消耗DPPH·物質量nD的關系曲線。

考慮DPPH溶液的不穩定性，實驗應該盡量在避光條件密閉條件下進行。

1.2.2 DPPH·清除試驗

用于對照試驗的DPPH·清除試驗采用常規方法，見文獻[19-20]。在避光條件下，取一定濃度DPPH溶液至10m L比色管中，分別加入不同濃度的山奈酚溶液，混勻，加比色皿塞，待反應20min后，測定其在517nm處吸光度（Aj），測定試劑空白溶液吸光度（A0）以及相應山奈酚溶液吸光度（Ai），計算DPPH自由基清除率（E）。

2 結果與分析

2.1 吸收曲線及反應時間

DPPH·的光度分析通常以DPPH溶液在517nm處的褪色反應為基礎，若所測定的活性物質在517nm附近也存在吸收，則可能對DPPH·光度測定帶來干擾，所以需考查所研究樣品對DPPH·光譜吸收的影響。DPPH·和山奈酚溶液UV-Vis光譜測定結果見圖1，DPPH·在328、517nm處有兩個強吸收峰，與文獻[19]一致。而山奈酚溶液則在267、368nm處有兩個吸收帶，山奈酚的的光譜吸收對DPPH·在517nm處的吸收無干擾。圖1表明，DPPH溶液中與不同濃度的山奈酚反應后，DPPH在517nm處的吸收逐漸降低，并呈劑量-效應關系。因此，通過測定DPPH溶液在517nm處的褪色反應，可準確反應山奈酚對DPPH·的清除作用。

圖1 DPPH、山奈酚的吸收曲線以及DPPH與不同濃度山奈酚反應的吸收光譜曲線Fig.1 UV-Vis absorption spectrogram of DPPH and kaempferol，and DPPH w ith different concentrations of kaempferol

滴定分析是基于滴定劑與被滴定物質反應達平衡時的計量關系為基礎，而不同的活性物質與DPPH·反應達到平衡的時間可能存在著差異性，反應到達平衡后進行測定才能保證測定的準確性。鑒于此，本文首先考查了DPPH溶液在測定條件下的穩定性，研究表明：室溫下（21℃）DPPH溶液在1 h內具有良好的穩定性，但在見光和敞開的條件下，放置時間超過1h，新鮮配制的DPPH溶液紫紅色將變淺，吸光值下降，放置5h和10h后，DPPH溶液吸光度僅分別約為初始值的4/5和3/5。為確保結果的準確性，實驗應在避光且使用帶蓋比色皿，在避光及帶蓋比色皿條件下，2h內，新鮮配制的DPPH溶液吸光值基本保持不變，所以實驗應該低溫避光，上蓋且盡快完成。

由于不同濃度的活性物質與DPPH的反應有可能存在差異，本文以0.005mg·m L-1DPPH溶液與兩種濃度水平的山奈酚（高濃度為 0.0035mg·m L-1，低濃度為 0.0005mg·m L-1）進行反應，研究反應時間對山奈酚與DPPH·反應的影響，結果見圖2。在0.005mg·m L-1DPPH溶液中加入高低濃度的山奈酚，吸光度迅速減小，但達到反應平衡的時間不同。加入0.0005mg·m L-1山奈酚，10min后吸光度到達穩定，而加入 0.0035mg·m L-1山奈酚后迅速下降，3min后吸光度幾乎不變，說明 0.005mg·m L-1DPPH與0.0005mg·m L-1和0.0035mg·m L-1山奈酚反應達平衡時間分別為10min和3min，即濃度增加，山奈酚與DPPH·反應達到平衡時間將延長。本文的研究中，為保證在山奈酚與DPPH·反應達到平衡時進行測定，微量光度滴定法因每次加入的山奈酚量很小，所以選擇在加入后3min進行測定，而在對照試驗中，因加入山奈酚量相對較大，選擇在加入后20 min進行測定。

圖2 反應時間對山奈酚與DPPH反應的影響Fig.2 The effect of reaction time on the absorbance of DPPH reacting w ith kaempferol

2.2 微量光度滴定曲線及化學計量關系

根據 1.2.1方法，本文選擇了高（22.82×10-8mol/10m L）、中（15.22×10-8mol/10m L）和低（7.60×10-8mol/10m L）3個初始濃度的DPPH溶液，測定山奈酚對3種濃度的DPPH·的滴定曲線（DPPH濃度的選擇原則是盡量使其吸光度值在0.3～0.8之間，以保證測定的精度）。結果見圖3。從圖中可知，與山奈酚反應后，DPPH·在 517nm的吸光值呈線性下降，但山奈酚加入量達到一定濃度時，滴定曲線出現1個拐點，DPPH·吸光度趨于穩定，表明山奈酚清除DPPH已達最大，滴定曲線的拐點可視為滴定終點，對滴定曲線拐點前的線性部分作回歸分析，對于高、中、低三個濃度的 DPPH·，線性回歸方程分別為 A=-0.0247x +0.8377（R2=0.9994）、A=-0.0235x +0.5464（R2=0.9995）和 A=-0.0226x +0.2977（R2=0.9992）。式中，A為DPPH·在517 nm處吸光度，x為山奈酚濃度，R2為相關系數，三個的相關系數R2值可看出，滴定曲線線性關系良好，精密度較高。

圖3 微量光度滴定曲線Fig.3 The curve of micro-photometric titration

依照1.2.1方法，分別計算出不同DPPH·初始量山奈酚加入量nK及所消耗的DPPH·物質量nD的關系，結果見圖4。nK與nD的關系曲線，該曲線的線性部份反映了滴定過程山奈酚與DPPH·的化學計量關系，滴定終點時（拐點）對應的DPPH·消耗量（nDmax）則反映了山奈酚能清除的最大DPPH·量，通過nDmax可以計算山奈酚對DPPH最大清除率ECmax，ECmax=nDmax/n0，式中，n0為DPPH初始量。從圖4可知，到達滴定終點前，盡管DPPH初始量不同，nK與nD曲線均具有良好的線性關系，且三條曲線幾乎重疊，說明反應過程中山奈酚均遵循幾乎相同的化學計量關系與DPPH進行反應。本文以DPPH消耗量nD與山奈酚加入量nK化學計量數比（nD/nK）[21]表示這種化學計量關系，表1是不同DPPH初始量滴定過程中的nD/nK和ECmax計算結果。從表1可知，在滴定過程中，隨著山奈酚逐漸加入，nD/nK幾乎不變，且不同DPPH起始量的nD/nK并無顯著差異，當DPPH初始量(×10-8mol)為7.60、15.22和22.82時，山奈酚對DPPH最大清除率ECmax（nDmax/n0，100%無明顯差異，分別為：82.89%，84.88%和84.22%，說明滴定過程中nD/nK和nDmax/n0不因DPPH濃度不同而變化。表1可看出，測定精密度依DPPH初始量增加而增加，不同DPPH初始量(×10-8mol)的相對標準偏差（RSD %）順序是：22.82（2.75）<15.22（3.29）<7.60（5.66），說明過低的DPPH起始量不利于測定的精密度與準確性。

圖4 山奈酚加入量（nK）及所消耗DPPH量（nD）的關系Fig.4 The relationship of Kaempferol dosage (nK) and the amount consumed of DPPH (nD)

山奈酚與DPPH的化學計量關系反映了山奈酚清除DPPH的能力，常規自由基清除試驗以清除率達50%時抗氧化劑濃度（EC50%）表達其清除自由基的能力，但EC50%隨自由基的初始量而明顯不同，目前文獻所報道的DPPH清除試驗中，DPPH初始量不盡相同，因此，所獲得的EC50%值不具有可比性。而本文提出的微量光度滴定法以滴定過程中抗氧化劑與DPPH的化學計量數比不隨DPPH初始量相同而變化，因此，化學計量數比表達其清除自由基的能力更加合理，可比性好，且本文的方法所獲得的化學計量數比精密度好，結果更可靠。

表1 微量滴定過程化學計量數比（nD/nK）、最大清除率（ECmax）和半數清除率（EC50%）測定結果Table.1 The results of stoichiometric ratio (nD / nK), the maximum scavenging rate (ECmax) and half of the scavenging rate (EC50%) of micro-photometric titration

15.22 1.78 1.77 1.72 1.72 1.79 1.72 1.74 1.79 1.88 1.82 1.89 1.88 1.87 1.80 1.77 1.72 1.78 3.29 84.88 0.0428 22.82 1.63 1.66 1.66 1.69 1.70 1.77 1.76 1.76 1.78 1.80 1.77 1.81 1.81 1.80 1.78 1.79 1.79 1.74 1.74 1.76 1.73 1.78 1.79 1.80 1.80 1.82 1.81 1.82 1.80 1.76 1.75 1.73 1.76 2.75 84.22 0.0648

2.3 對照試驗

對微量光度滴定法與常規DPPH清除分光光度法進行對照試驗，目前文獻報告的常規方法DPPH的濃度不盡相同，選擇的依據是保證測量條件下具有一定初始吸光度（A0,通常在0.5～0.7之間），以保證測定的準確性。在本文的研究中，常規方法與微量光度滴定法選擇的比色皿分別為1.0cm和3.0cm，因此，常規方法和微量光度滴定法DPPH初始量分別為7.1×10-4mmol（濃度為0.142mmol/L，A0為0.74）和2.1×10-7mol（濃度為0.042mmol/L， A0為0.68）。對照試驗的結果見表2。從表2可知，盡管計算方法不同，但本法與常規方法的最大清除率ECmax和半數清除濃度EC50%（相當于常規方法DPPH初始量）結果相近，而本文的ECmax和EC50%測定結果相對標準偏差（RSD）更低，說明本法具有正好的精密度，按照表2 DPPH初始量，對本法進行連續5d測定，測得nD/nK和EC50%的RSD值為4.17%。從山萘酚消耗量看，常規方法需使用DPPH樣品系列以測定不同劑量山萘酚的清除作用，而本法通過在同一個DPPH樣品中滴加微量山萘酚，完成一組測定時山萘酚及 DPPH消耗大大減少。以蘆丁作為對照，在相同條件下用本法測定了蘆丁的nD/nK、ECmax（%）和EC50%，從結果看山奈酚的nD/nK略高于蘆丁，EC50%略低于蘆丁，表明山奈酚抗氧化活性略高于蘆丁，抗氧化活性較好。

表2 常規方法與本法試驗結果對照Table2 The results of general and this new method comparison

3 結論

本文提出一種新型活性成分DPPH自由基清除活性的微量光度滴定法，通過山奈酚清除DPPH自由基的紫外-可見吸收光譜學特征研究，確定了山奈酚對DPPH自由基在517nm處的吸收無光譜干擾，研究了常規方法和本法的山奈酚與DPPH的反應時間分別為20min和3min，其反應達到平衡，確定了山奈酚與DPPH反應的化學計量關系為1:1.78，以此評價活性成分清除DPPH自由基的能力。通過與常規DPPH清除檢測方法進行對照對方法進行了驗證，結果表明本文提出的DPPH自由基清除活性的微量光度滴定法樣品使用量明顯下降且更精確，具有準確性好、簡單、易于普及、成本低等特點，應用前景較好，為抗氧化活性的微量化檢測提出了一種新的思路。

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