基因RFC-1多態性與神經管畸形發生的相關性研究

郭 麗，解 軍

(1．臨汾職業技術學院，山西 臨汾 041000，2．山西醫科大學，山西 太原 030001)

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)是在基因組核苷酸基礎上出現變異而引起的DNA序列多態性，有單堿基的變換、顛倒以及插入或缺失等。在基因組中平均每1 000 bp就約有一個SNP。SNP與致病基因的搜查、種群多樣性的研究，特別是與人類的遺傳特征密切相關，因此，SNP可廣泛用于診斷學和治療學。

神經管畸形(neural tube defects，NTDs)是神經管在胚胎發育過程中因閉合不全而引起的一種先天性缺陷性疾病［1］。顱骨閉合失敗導致無腦畸形，是常見的致死原因;尾端閉合失敗通常導致脊髓脊膜膨出。NTDs是最常見的出生缺陷，該病的發病機制受到遺傳、環境、營養等多種因素共同作用，是交互影響而導致的結果，其中遺傳因子的作用更為突出。神經管畸形可導致胎兒流產、死亡及新生兒死亡等嚴重后果，山西省發病率高達10‰［2］，嚴重影響新生兒的生存質量。在受孕前給母親補充葉酸能夠減低NTDs的風險。

葉酸衍生物是DNA的合成、細胞分裂、膜的生長、DNA甲基化所必需的，甲基化能在基因表達、染色體結構的維持中發揮作用，恰恰它們也正是胚胎發育的關鍵。動物模型實驗提示葉酸鹽的補充能對抗顱面畸形、神經管畸形的發生。

本研究通過檢測樣本的還原性葉酸載體(reduced folate carrier，RFC)基因多態性，預測了其蛋白質的空間結構，分析了其基因分型及頻率與神經管畸形發生之間的相關性，為今后制定神經管畸形有效的預防和篩查方案提供一定的科學依據。

1 資料與方法

1．1 一般資料

選取2012年3月～2013年12月在山西省臨汾市第一人民醫院、兒童醫院產科門診進行產前檢查的妊娠婦女539名。確診孕有神經管畸形兒的30名孕婦為病例組，同一時期正常妊娠的健康孕婦509名為對照組，兩組對象基本情況比較差異無統計學意義(P＞0．05)。見表1。

表1 兩組基本情況對比表Table 1 Comparison of Basic Condition between the Case and the Control Groups

1．2 實驗方法

1．2．1 采集樣本 本研究對象抽取2 mL空腹靜脈血，并進行抗凝處理。

1．2．2 提取 DNA 購買BioDev試劑盒，按照說明逐步從血液中提取DNA，保存在－20℃。

1．2．3 基因分型 由 TAKARA公司對 RFC-1基因A80G位點進行基因測序，將測序結果進行分型，并對其分析。

1．3 三級結構預測

應用Swiss Pdb viewer4．0軟件對比分析野生型與突變型RFC-1三級結構預測及分析。

1．4 統計學方法

使用統計軟件SPSS16．0進行統計分析，采用χ2檢驗對RFC-1 A80G多態性位點的基因型頻率和等位基因頻率的差異進行比較，Logistic回歸分析計算相對危險度(odds ratio，OR值)和95%可信區間(95%CI)，提示各基因型發生神經管畸形的風險。

2 結果

2．1 基因型分析RFC-1 A80G位測序結果

2．2 三級結構的預測結果

根據RFC-1基因的外顯子3的第80位出現一個高頻G－A的點突變，使得氨基酸由精氨酸轉化為組氨酸。預測突變結果可能的三級結構如圖1。

2．3 RFC-1基因型的比較(見表2)

表2 兩組RFC-1基因分型及等位基因頻率的比較Table 2 Comparison of RFC-1 Gene Polymorphisms and Allele Frequency between the Case and Control Groups

RFC-1 80位基因型分布頻率為神經管畸形兒孕婦組 AA15(50．0%)，AG10(33．3%)，GG5(16．7%)，對照組 AA40(80．0%)AG8(16．0%)，GG2(4．0%)，組間差異有統計學意義(χ2=8．386，P ＜0．05)。等位基因為神經管畸形兒孕婦組 A39(65．0%)，G21(35．0%)，對照組 A88(88．0%)，G12(12．0%)，組間差異具有統計學意義(χ2=12．117，P ＜0．05)。

RFC-1 80位與神經管畸形相關性分析:RFC-1 80位與AA基因型相比較，G等位基因和GG基因型的孕婦發生NTDs的相對風險明顯增加，分別為3．567，95%CI(1．923 ～ 5．976)，OR=6．101，95% CI(1．331 ～21．609)，差異具有統計學意義(P ＜0．05)。

圖1 三級結構預測結果Fig．1 Predicted Results of A Three－ dimensional Model

3 討論

在我國流行病學調查中，山西省神經管畸形的發病率居全國首位，嚴重影響新生人口質量，制約經濟發展，雖對孕婦進行孕期監測可以降低患兒出生率，但仍不能徹底消除。本研究從遺傳學角度入手，以孕育神經管畸形兒的孕婦為病例組，孕育正常兒的孕婦為對照組，采取基因測序的辦法［3］，對RFC-1基因在80位點由A-G突變進行了相關性研究，并對三維空間構象進行了分析。

研究發現，小量葉酸可以限制細胞分裂為甲硫氨酸的代謝，以增加孕婦機體血清中高半胱氨酸的含量。A80G是RFC-1常見的突變位點，它的突變直接或間接的影響基因活性降低，葉酸轉運缺陷，從而引起與葉酸代謝相關疾病發生風險的加大。RFC基因是在小腸組織中表達的葉酸載體，是葉酸運輸到細胞中必不可少的。當葉酸在小腸中吸收時，主要通過RFC途徑完成。若RFC-1基因出現點突變，會導致精氨酸轉化為組氨酸，改變其代謝途徑，從而影響葉酸的吸收效率。

本研究結果顯示，病例組 GG基因型頻率(16．7%)顯著高于對照組(4．0%)，且 OR 值為 6．101，提示發生NTDs的風險明顯增大。說明在山西漢族人群中，RFC-1基因A80G多態性時發生NTDs的風險因素高。若能在懷孕前進行RFC-1基因A80G的多態性篩查，并及時在受孕前后給予GG基因型婦女口服足量的葉酸，可降低NTDs的發生率。

本次研究樣本收集的例數較少，有一定的局限性，但本研究提供的數據表明了RFC-1和神經管畸形之間有相關性，葉酸代謝途徑異常在NTDs中有重要作用，應該作為神經管畸形研究的潛在危險因素。

［1］ Van der Put NM，Steergers-Theunissen RP，Frosst P，et al．Mutated Methylen Etertrahydrofolate Reductase as a Risk Factor for Spina Bifida［J］．Lancet，1995，346(10):1070-1071．

［2］ Yali Shang，Hong Zhao，Bo Niu，et al．Correlation of Polymorphism of MTHFRs and RFC-1 Genes with Neural Tube Defects in China［J］．Birth Defects Research Part A Clinical and Molecular Teratology，2008，82(1):3-7．

［3］ Stegmann K，Boecker J，Richter B，et al．A Screen for Mutations in Human Homologues of Mice Exencephaly Genes TFAP2-alpha and Msx2 in Patients with Neural Tube Defects［J］．Teratology，2001，63(5):167-75．