HPLC測定防風(fēng)通圣丸中麻黃堿含量的方法

晉 毅，閻愛榮

(山西省人民醫(yī)院，山西 太原 030012)

防風(fēng)通圣丸出自《宣明論方》，是金代名醫(yī)劉完素著名的代表方之一。古人云“有病無病，防風(fēng)通圣”，說明了防風(fēng)通圣丸用途之廣，集防與治于一體［1］。防風(fēng)通圣丸具有清熱解毒、解表通里的作用，傳統(tǒng)用于治療頭痛、發(fā)熱怕冷、咽喉疼痛、小便短赤等癥。其含有麻黃、防風(fēng)、連翹等十七味藥。許多含麻黃的中成藥常以麻黃堿作為定性及定量指標(biāo)，用于評(píng)價(jià)中成藥、中藥材質(zhì)量、制劑工藝及穩(wěn)定性的優(yōu)劣，便于制訂藥品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)［2］。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為應(yīng)用麻黃堿不安全，特別是麻黃堿用于非處方藥時(shí)可能引起嚴(yán)重不良反應(yīng);另外，麻黃堿及其制劑具有藥品和易制毒品的雙重屬性，除受到藥品管理法規(guī)的約束外，還受到專項(xiàng)監(jiān)管法規(guī)、藥品類易制毒化學(xué)品和含興奮劑藥品等相關(guān)法規(guī)和文件的制約。

鑒于含麻黃堿藥物的特殊性，為了體現(xiàn)藥品質(zhì)控指標(biāo)的專屬性，提高檢查結(jié)果的正確性和可靠性，建立一種準(zhǔn)確、快速、高靈敏的檢測中藥中麻黃堿含量的方法勢在必行，以便有效地控制中藥中麻黃堿的含量。本研究采用高效液相色譜(HPLC)法，建立了防風(fēng)通圣丸中麻黃堿的含量測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

waters公司510-717-2996高效液相色譜儀;empower液相色譜工作站2996檢測器;色譜柱:Aichrom-Bond-AQ C18(150 mm ×4．6 mm，5 μm);乙腈:色譜純(天津彪仕奇科技發(fā)展有限公司);水:高純水;其余試劑均為分析純;對(duì)照品:鹽酸麻黃堿(批號(hào)為171241-200404，含量測定用)，由中國藥品生物制品檢定所提供;供試品:防風(fēng)通圣丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠(批號(hào):9081746)。

2 方法

2．1 色譜分析條件

色譜柱:AichromBond-AQ C18(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 － 水 － 磷酸 － 三乙胺 (3∶97∶0．1∶0．1);檢 測 波 長:205 nm;柱 溫:35℃;流 速:0．80 mL·min－1;理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計(jì)算，應(yīng)不低于5000。在此條件下，鹽酸麻黃堿與其他組分均能達(dá)到基線分離。

2．2 對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸麻黃堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含8 μg的溶液，即得。

2．3 供試品溶液的制備

取本品粉碎，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入酸性甲醇(磷酸1 mL→100 mL)25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(220 kw，44 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用酸性甲醇(磷酸1 mL→100 mL)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2．4 檢測波長的選擇

取鹽酸麻黃堿對(duì)照品，在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在205 nm處有最大吸收，故選擇205 nm作為檢測波長。

2．5 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2．5．1 提取溶劑和提取條件的選擇 取本品粉末1 g，分別加入甲醇、酸性甲醇(磷酸1 mL→100 mL)各25 mL，超聲提取30 min，分別制備供試液。另取本品粉末2 g，加入濃氨試液5 mL，乙醚適量，索氏提取至提取液無色，將提取液移至蒸發(fā)皿中，揮干乙醚，加磷酸5 mL酸化后，加甲醇洗置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為供試液。照上述色譜條件測定，結(jié)果表明，堿性乙醚索氏提取與酸性甲醇超聲提取含量無明顯差異，故選用酸性甲醇超聲提取的方法。見表1。

表1 提取溶劑的選擇Table 1 The Selection of Extraction Solvent

2．5．2 超聲時(shí)間的選擇 取本品粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入酸性甲醇(磷酸1 mL→100 mL)25 mL，密塞，稱定重量，分別超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10、30、60 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜(0．45 μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試液。照上述色譜條件測定，結(jié)果表明:超聲提取30 min后鹽酸麻黃堿已基本提取完全，故選擇超聲時(shí)間為30 min。見表2。

表2 超聲時(shí)間影響Table 2 The Influence of Ultrasonic Time

2．5．3 溶劑量的選擇 取本品粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入酸性甲醇(磷酸1 mL→100 mL)10、25、50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜(0．45 μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試液。照上述色譜條件測定，結(jié)果表明:溶劑量為25 mL時(shí)，鹽酸麻黃堿已基本提取完全，故選擇樣品量為1 g，溶劑量為25 mL。見表3。

表3 溶劑量的選擇Table 3 The Selection of Solvent Quantity

2．6 線性關(guān)系考察

精密吸取鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液(0．016 256 mg/mL)1、3、5、7、9、15 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，鹽酸麻黃堿進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y=3 204 469．77x+7 050．91，r=0．999 9。結(jié)果表明鹽酸麻黃堿在0．016～0．244 μg范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。見表4。

表4 線性關(guān)系考察Table 4 Results of Linear Relationship

2．7 空白試驗(yàn)

按處方中藥味比例，自配不含鹽酸麻黃堿的群藥，按其制法制成空白制劑，照供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液，依法測定，結(jié)果陰性對(duì)照溶液在與鹽酸麻黃堿對(duì)照品相同保留時(shí)間處未顯色譜峰，故認(rèn)為無干擾。見圖1。

圖1 對(duì)照品(a)、樣品(b)、陰性樣品(c)的HPLC色譜圖Fig1． HPLC Chromatograms of Reference Substances(a)，Sample(b)and Negative Sample(c)

2．8 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、16、24 h，依法測定。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性考察Table 5 Results of Stability Test

2．9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱定防風(fēng)通圣丸(批號(hào):9081746)1 g，平行6份，按上述色譜條件進(jìn)行測定，求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1．47%。結(jié)果表明，本方法重現(xiàn)性良好，見表6。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 6 Results of Repeatability Tests(n=6)

2．10 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱取已知含量的同一批號(hào)(含量0．186 mg/g)樣品0．5 g，平行制樣 6 份，分別精密加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品0．097 5 mg，依法測定，按下式計(jì)算回收率，結(jié)果表明本法具有 良 好的回收率，見表7。

表7 鹽酸麻黃堿加樣回收率Table 7 Revovery Rates of Ephedrine Hydrochloride

3 結(jié)果

取防風(fēng)通圣丸樣品，按照上述方法測定樣品含量，以下列公式計(jì)算鹽酸麻黃堿含量，結(jié)果見表8。

Cs:對(duì)照品溶液的濃度(mg/mL);

Vs:對(duì)照品溶液的進(jìn)樣體積(μL);

Ai:樣品中被測物的峰面積;

As:對(duì)照品的峰面積;

Vi:樣品的進(jìn)樣體積;

Wi:樣品的稱樣量(g)。

表8 樣品測定結(jié)果Table 8 The Results of Sample Determination

4 討論

中藥具有良好的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，但同時(shí)也缺乏明確的、可操作性強(qiáng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制方法。提高中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，形成現(xiàn)代化的質(zhì)量控制方法體系勢在必行。本研究對(duì)比了不同的提取方法對(duì)麻黃堿提取效率的影響，采用HPLC法測定防風(fēng)通圣丸中麻黃堿的含量。結(jié)果表明采用酸水－超聲波方法提取麻黃堿，操作便捷，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，提取效率高，可以作為其質(zhì)量控制的分析方法。同時(shí)，也為麻黃藥材及其他含麻黃堿的中藥材的進(jìn)一步研究提供了可參考的測定方法。

［1］ 藏海洋．防風(fēng)通圣丸臨床妙用［J］．家庭中醫(yī)藥，2010，17(1):51．

［2］ 何 群，周朝輝，劉學(xué)瓊，等．含麻黃中成藥及生物體液中麻黃堿定量方法研究概況［J］．中成藥，1999，21(2):90-91．