自擬消渴一號方對糖尿病腎病模型大鼠NF-κB和TNF-α影響的實驗研究

史銳 馬賢德

遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847

自擬消渴一號方對糖尿病腎病模型大鼠NF-κB和TNF-α影響的實驗研究

史銳 馬賢德

遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847

目的初步探究自擬消渴一號方對糖尿病腎病模型大鼠腎臟保護作用的免疫炎癥反應抑制機制。方法在2011年9月—2012年9月的實驗研究過程中，將45只SD大鼠隨機分為3組，每組15只：空白對照組（A）、中藥組（B）、模型組（C）。A組不予任何處理，正常飼養，B、C兩組采用高糖高脂飲食聯合單側腎切除加小劑量STZ方法復制糖尿病腎病大鼠模型成功后，分別給予自擬消渴一號方和等量生理鹽水灌胃治療，連續治療4周后，檢測各組大鼠腎臟組織中NF-κB和TNF-α的變化。與空白對照組比較，DN模型組大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白表達及TNF-α含量顯著上調（P＜0.01），而自擬消渴一號方能夠有效下調二者的表達，與模型組比較有統計學意義（P＜0.01）。結論自擬消渴一號方對糖尿病腎病模型大鼠的腎臟具有保護作用，其作用機制可能與抑制糖尿病腎病模型大鼠的免疫炎癥反應有關。

糖尿病腎病；NF-κB；TNF-α

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病較為嚴重的并發癥之一，也是糖尿病患者重要的致死原因之一。多年來，研究者一直在不斷的探索治療DN的新方法、新方藥。自擬消渴一號方是根據糖尿病早期的發病原因及DN出現后的癥候特征而擬定，已應用于臨床，療效較為滿意，但具體療效機制不明。研究發現，免疫炎癥反應是糖尿病腎病的重要發病環節之一，核轉錄因子κB(nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB)、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor；TNF-α）則是參與此環節的重要細胞因子。該實驗則以NF-κB、TNF-α為主要觀察指標，探究消渴一號方是否能夠抑制糖尿病腎病模型大鼠的免疫炎癥反應，為明確消渴一號方的療效機制奠定理論基礎。在2011年9月—2012年9月的實驗研究過程中，將45只SD大鼠隨機分為3組，每組15只：空白對照組（A）、中藥組（B）、模型組（C）。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級雄性SD大鼠45只，隨機分為4組，空白對照組（A）、中藥組（B）、模型組（C）。所有動物購自中國醫科大學,許可證號為SCXK（遼）2008-0005,體重200±20 g。適應性飼養1周后進行實驗，12小時周期節律，自由進水進食。

1.2 模型制備及給藥

A組不予任何處理，正常飼養，B、C兩組動物給予高糖高脂飲食喂飼8周，飼料配方為常規飼料內加20%蔗糖，10%豬油，2.5%膽固醇。然后行右側腎切除術，術后飼養2周；2周后再經腹腔注射STZ，劑量為40 mg/kg。給藥后72 h尾尖采血檢測血糖，以血糖高于16.7 mmol/L為模型復制成功[1]。

造模成功后，B組給予自擬消渴一號方煎劑灌胃治療，劑量為1.2 g生藥/kg大鼠體重；C組給予等量（指體積）生理鹽水灌胃，連續治療4周。

1.3 主要儀器及試劑藥品

三諾安穩型血糖儀及血糖檢測試紙，購自成大方圓連鎖藥店。酶聯免疫吸附法檢測大鼠TNF-α試劑盒購自上海越研生物科技有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司。中藥飲片購自遼寧中醫藥大學附屬醫院。

方劑組成：黨參30 g、黃芪30、麥門冬15 g、天花粉15 g、五味子10 g、紅花15 g、葛根15 g、蟬蛻10 g、桑螵蛸15 g、肉桂10 g、鹿茸10 g、地龍10 g、地鱉蟲10 g。

1.4 標本采集與指標檢測

1.4.1 Western-blot法檢測腎臟組織中NF-κB的表達從腎臟組織中提取總蛋白，電泳，轉膜。將稀釋100倍的兔抗大鼠NF-κB一抗工作液置于直徑為9 cm的培養皿中，HRP標記的山羊抗兔二抗稀釋100倍后置于另一直徑為9 cm的培養皿中，進行免疫反應，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育60 min。洗膜后進行ECL化學發光顯影。

1.4.2 ELISA法檢測腎臟組織中TNF-α的含量將各組大鼠腎臟組織以1:10比例與PBS緩沖液混合制備組織勻漿，采用酶聯免疫吸附法檢測腎臟組織勻漿中TNF-α的含量。

表1 各組大鼠腎臟中NF-κB表達及TNF-α含量(±s)

表1 各組大鼠腎臟中NF-κB表達及TNF-α含量(±s)

注：與模型組比較，☆表示P＜0.01，有統計學意義。

組別n NF-κB（積極分光密度值，比值）TNF-α（ng/L）空白對照組中藥組模型組10 10 10 FP（0.550±0.028）☆（0.721±0.063）☆1.019±0.050 233.566 0.000（38.68±5.83）☆（53.11±6.65）☆75.95±8.73 68.587 0.000

圖1 各組大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白的表達

1.5 統計方法

實驗數據均采用spss10.0軟件包進行統計分析，各組數據以均數±標準差表示，多組數據間比較采用方差分析。

2 實驗結果

2.1 糖尿病腎病大鼠模型復制成功

該實驗采用高糖高脂飲食+手術+STZ法復制糖尿病腎病大鼠模型，造模后尾尖采血檢測大鼠血糖，血糖均高于16.7 mmol/L，模型復制成功。

2.2 NF-κB蛋白表達及TNF-α含量檢測

與空白對照組比較，DN模型組大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白表達及TNF-α含量顯著上調（P＜0.01），而自擬消渴一號方能夠有效下調二者的表達，與模型組比較有統計學意義（P＜0.01）。各組大鼠NF-κB表達及TNF-α含量詳見表1、圖1。

3 討論

糖尿病,屬于中醫“消渴”范疇,而DN屬于中醫“腎勞”范疇,我們根據糖尿病早期的發病原因及DN出現后的癥候特征擬定出自擬消渴一號方，對早期糖尿病腎病進行防治，已應用于臨床，療效較為滿意。但治療機理不明。

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor；TNF-α），是體內的重要炎性因子，在腎臟中很多細胞均可產生TNF-α。多種因素也可刺激TNF-α的合成及分泌，如：DN模型大鼠的高糖狀態；體內因氧化劑產生過多而處于氧化應激狀態；各種細胞因子分泌的失衡狀態，都可以刺激機體產生TNF-α。TNF-α在體內發揮著各種生物學作用，除了殺傷腫瘤細胞外，免疫損傷作用尤為重要，并且免疫損傷的程度與TNF-α的含量成正比[2]。該研究中選用的自擬消渴方可以有效抑制TNF-α的表達，從而減輕了DN模型大鼠體內蓄積過量的TNF-α對機體產生的免疫損傷。這可能是自擬消渴一號方對DN模型大鼠治療作用的機理之一。

核轉錄因子κB(nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB)是一種分布和作用均十分廣泛的真核細胞轉錄因子。NF-κB是多種信號傳導途徑的匯聚點,可雙向調控一系列基因的表達,這些基因的表達產物在炎癥和自身免疫等反應中起重要作用。同時，NF-κB是一種多向因子，不僅具有抑制細胞凋亡作用，還有促進細胞凋亡的作用，不同的條件及刺激下體現出促凋亡和抗凋亡的雙重特性[3-4]。該研究結果表明，NF-κB在DN的發生發展過程中發揮著促凋亡作用，與空白對照組比較，模型組DN模型組大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白表達顯著上調（P＜0.01），而經過自擬消渴一號方治療后，NF-κB蛋白的表達得到了很好的控制。因此，我們推測這可能是自擬消渴一號方對DN模型大鼠治療作用的又一機理。

當然，模型的成功制備為本實驗的順利進行提供了重要保障。我們前期的研究結果表明，高糖高脂+手術+STZ法復制糖尿病腎病模型具有成模率高，成模時間短，病理改變與臨床貼近等優點。此方法復制的糖尿病腎病模型大鼠的血脂，血糖，血胰島素，24 h尿蛋白均明顯高于空白對照組。因此，該實驗采用此方法進行糖尿病腎病大鼠模型的制備。

另外，根據文獻報道，TNF-α能夠刺激NF-κB信號轉導通路的激活，而NF-κB被激活后又反過來影響TNF-α的表達。故自擬消渴一號方很有可能還具有抑制NF-κB信號轉導通路的作用，這將有待于進一步研究。

[1]徐穎,周世文,湯建林.實驗性糖尿病腎病大鼠模型建立及優化[J].第三軍醫大學學報,2006,28(22):2248-2249.

[2]熊盈.TNFα、NFκB誘導糖尿病大鼠腎臟細胞凋亡及雷帕霉素干預影響[D].中國醫科大學，2010.

[3]肖樺，楊秋萍，趙燕，等.燈盞花素對糖尿病大鼠腎組織NF-κB和腎功能影響的實驗研究[J].陜西中醫，2008，29（5）:624-626.

[4]秦貴軍，岳欣閣，張賀，等.糖尿病大鼠腎小球IL-18、ICAM-1和TNF-α表達的實驗研究[J].中國糖尿病雜志，2008，16（9）：541-543

R587.1

A

1672-4062（2014）07（b）－0024-02

2014-04-20）

史銳（1979-），男，遼寧本溪人，碩士，副教授，從事化學教學與藥物研發工作。