核桃內種皮多酚提取工藝及其體外抗氧化活性的初步研究

張春梅，陳朝銀，趙聲蘭*，黃再強，樊啟猛（.云南中醫學院中藥學院，云南昆明650500；.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500）

核桃內種皮多酚提取工藝及其體外抗氧化活性的初步研究

張春梅1，陳朝銀2，趙聲蘭1*，黃再強1，樊啟猛1
（1.云南中醫學院中藥學院，云南昆明650500；2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500）

采用單因素試驗和正交試驗優化核桃內種皮多酚的回流提取工藝條件，采用清除羥自由基（·OH）、超氧陰離子（·O2-）、過氧化氫（H2O2）評價核桃內種皮多酚的體外抗氧化活性。結果表明，核桃內種皮多酚提取工藝條件：乙醇體積分數45%、液固比60:1 (mL∶g)、提取溫度70℃、提取時間60 min。在此條件下，多酚得率為25.05%。核桃內種皮多酚具有顯著的清除·OH、·O2-和H2O2的能力，其中，當質量濃度為160 μg/mL時，對·OH的清除率達100%，優于維生素C。

核桃內種皮；多酚；提取工藝；抗氧化活性

核桃仁系胡桃科（Juglandaceae）植物胡桃（Juglans regial.）的成熟種子，《本草綱目》記載，核桃仁具有補氣養血、潤噪痰、益命門、利三焦等多種功效[1]。核桃仁作為一種傳統醫食兩用的健康食品[2]，越來越受到人們的廣泛關注。我國核桃種植資源非常豐富，研究表明，核桃除富含營養價值較高的蛋白質和脂肪酸外，還含有大量的具有降血脂、降膽固醇、防止動脈粥樣硬化、延緩衰老等保健功能的多酚、黃酮、VE等[3-4]，核桃仁中對人體有益的多酚類物質主要集中在種皮部分[5]，且核桃內種皮中集中了核桃仁90%以上的抗氧化物質[6]。本研究主要探討核桃內種皮多酚的回流提取工藝及其提取物的體外抗氧化活性，為核桃內種皮的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃內種皮：產自云南漾濞的新鮮核桃，破殼取仁，趁鮮分離出核桃內種皮，室溫條件下自然干燥，粉碎過20目篩。Folin-Ciocalteu試劑：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸對照品：西安開來生物工程有限公司；鄰苯三酚、鄰二氮菲、碳酸鈉、乙醇等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV759S紫外-可見分光光度計：上海精科儀器有限公司；CP214電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HWS-18電熱恒溫水浴鍋：上海醫療器械五廠。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的建立及多酚的測定[7]

稱取0.0050g沒食子酸對照品，于50mL容量瓶中用蒸餾水溶解并定容，得100 μg/mL沒食子酸標準溶液，臨用現配。分別準確吸取上述對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL于10mL具塞試管內，加水補足至1 mL，搖勻，加入5.0 mL 10%的Folin-Ciocalteu試劑，充分搖勻，5 min后加入7.5%碳酸鈉溶液4.0 mL，搖勻，25℃條件下避光放置反應1 h，在波長765 nm處測吸光度值。以吸光度值為縱坐標，沒食子酸溶液質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

按標準曲線的建立方法，測定供試品溶液的吸光度值，通過沒食子酸標準曲線計算樣品中的多酚含量（以沒食子酸計），多酚得率計算公式如下：

式中：m1為樣品中多酚的含量，g；m2為樣品質量，g。

1.3.2 核桃內種皮多酚提取工藝的優化[8-9]

1）單因素試驗

A溫度的選擇：精密稱取0.2 g干燥的核桃內種皮5份，分別按50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，在乙醇體積分數60%，液固比60∶1（mL∶g），提取時間60 min的條件下浸提2次，合并提取液，用Folin-Ciocalteu比色法測定多酚，研究不同提取溫度對多酚提取的影響。

B液固比的選擇：精密稱取0.2 g干燥的核桃內種皮4份，按上述試驗確定的溫度，在乙醇體積分數60%的條件下，液固比（mL∶g）分別按40∶1、60∶1、80∶1、100∶1浸提2次，每次60 min，合并濾液，用Folin-Ciocalteu比色法測定多酚，研究不同液固比對多酚提取的影響。

C提取時間的選擇：分別精密稱取0.2 g干燥的核桃內種皮5份，按乙醇體積分數60%、上述確定的提取溫度和液固比，分別提取30 min、60 min、90min、120min、150 min，浸提2次，合并濾液，用Folin-Ciocalteu比色法測定多酚含量，研究不同提取時間對多酚提取的影響。

D乙醇體積分數的選擇：分別稱取0.2 g干燥的核桃內種皮5份，按上述確定的提取溫度、液固比和時間，選擇乙醇體積分數分別為40%、45%、60%、75%、90%，浸提2次，合并濾液，用Folin-Ciocalteu比色法測定多酚含量，研究不同乙醇體積分數對多酚提取的影響。

2）提取工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗進行提取工藝的優化。以乙醇體積分數（A）、提取時間（B）、液固比（C）、提取溫度（D）為考察因素，因素與水平見表1。

表1 核桃內種皮多酚提取工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for polyphenols extraction process optimization from walnut kernel pellicle

1.3.3 核桃內種皮多酚的體外抗氧化活性測定

1）對羥自由基（·OH）的清除作用[10]

采用Fention反應體系，利用鄰二氮菲與Fe2+反應生成有色配合物，該配合物在波長536 nm處有最大吸收的原理進行測定。H2O2/Fe體系產生的羥自由基（·OH）氧化鄰二氮菲-Fe2+生成鄰二氮菲-Fe3+，A536nm值減少，利用待測樣品對體系中·OH的清除作用，抑制A536nm減少，進而測定待測樣品對·OH的清除作用。

取10 mL具塞試管，以抗壞血酸（VC）為陽性對照，分別依次加入不同濃度核桃內種皮多酚溶液（或等濃度VC溶液）1 mL，1 mL 0.75 mmol/L的FeSO4，1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲，1 mL 0.01%H2O2，37℃保溫1 h后，測定A536nm。損傷管和未損傷管不加抑制劑，損傷管含1 mL的H2O2，未損傷管不加H2O2。羥基自由基清除率計算公式：

式中：A0為試劑未損傷吸光度值；A1為試劑損傷管吸光度值；A2為樣品未損傷管吸光度值；A3為樣品損傷管吸光度值。

2）對超氧自由基（·O2-）的清除作用[11]

采用鄰苯三酚自氧化法，取10 mL具塞試管，依次加入50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液1.5 mL，蒸餾水1.5 mL，搖勻，25℃恒溫20 min，取出，立即加入25℃預熱3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速混勻，在波長325 nm處每隔30 s測定1次吸光度值，計算線性范圍內每1 min吸光度的增加值，即鄰苯三酚的自氧化速率ΔA對照。按上法在加入鄰苯三酚前，先加入一定量的核桃內種皮多酚溶液，測定ΔA樣品。超氧自由基清除率計算公式：

式中：ΔA對照為1 min內對照管吸光度的變化值；ΔA樣品為1 min內對照管吸光度的變化值。

3）對過氧化氫（H2O2）的清除作用[12]

pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制的H2O2溶液在波長230 nm處有特征吸收，當加入對H2O2有抑制作用的物質時，溶液在波長230nm處的吸光度值減小，測定A230nm可計算對H2O2的清除率。

取10 mL的具塞試管，分別加入以50 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液配制的40 mmol/L H2O2溶液2.4 mL，再加入不同濃度的核桃內種皮多酚溶液（或VC溶液），用水補足至10 mL，混勻，10 min后測量A230nm。試驗中以不加樣品的H2O2溶液為空白對照，以不加H2O2溶液為樣品對照組。H2O2清除率計算公式：

式中：A0為空白對照組的吸光度值；A1為樣品組的吸光度值；A2為樣品對照組的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

按1.3.1方法以吸光度值A為縱坐標，沒食子酸質量濃度C為橫坐標，測得沒食子酸的線性回歸方程A=0.011 4C+ 0.018 9，回歸系數r=0.999 1，沒食子酸在質量濃度為0～80 μg/mL內，質量濃度與吸光度值呈良好的線性關系。2.2核桃內種皮多酚提取工藝單因素試驗

2.2.1 溫度對核桃內種皮多酚提取得率的影響

乙醇體積分數60%，液固比60∶1（mL∶g），提取時間60 min，提取溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，提取溫度對多酚得率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對多酚得率的影響Fig.1 Effect of temperature on polyphenols extraction yield

由圖1可知，在試驗溫度范圍內，隨著溫度增加，核桃內種皮多酚的提取得率呈先增加后降低趨勢，溫度較低的情況下，多酚得率較低，當溫度升高至80℃時，多酚提取率降低，可能是由于溫度過高，破壞了核桃內種皮多酚。溫度70℃時，多酚得率最高，達24.63%，故采用70℃作為浸提的適宜溫度。

2.2.2 液固比對核桃內種皮多酚得率的影響

乙醇體積分數60%，提取溫度70℃，時間60 min，液固比分別為40∶1、60∶1、80∶1、100∶1（mL∶g），液固比對多酚得率的影響見圖2。

圖2 固液比對多酚得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on polyphenols extraction yield

由圖2可知，隨著液固比的增加，核桃內種皮多酚的得率逐漸增加，當液固比為60∶1（mL∶g）時，多酚得率為24.43%；當液固比＞60∶1（mL∶g）時，多酚得率增加不多，故選擇60∶1（mL∶g）為最適液固比。

2.2.3 提取時間對核桃內種皮多酚得率的影響

乙醇體積分數60%，提取溫度70℃，液固比60∶1（mL∶g），提取時間分別為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，考察時間對多酚得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on polyphenols extraction yield

由圖3可知，隨著提取時間增加，多酚得率呈先增后減的趨勢，提取時間較長，可能導致多酚物質破壞，得率降低。60～120 min多酚得率變化不大，選擇60 min為適宜的提取時間。

2.2.4 乙醇體積分數對核桃內種皮多酚得率的影響

提取溫度70℃，時間60 min，液固比60∶1（mL∶g），乙醇體積分數分別為40%、45%、60%、75%、90%，乙醇體積分數對多酚得率的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數對多酚得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on polyphenols extraction yield

由圖4可知，乙醇體積分數為40%～45%時，隨乙醇體積分數的增加，多酚提取率增加，當乙醇體積分數45%時，多酚得率為24.52%，乙醇體積分數為45%～60%時，多酚得率趨于平穩。當乙醇體積分數繼續升高時，得率反而降低，故選擇乙醇體積分數45%。

2.3 核桃內種皮多酚提取工藝正交試驗

以乙醇體積分數、提取時間、液固比、提取溫度為因素，以多酚得率為考察指標進行正交試驗，正交試驗結果見表2。

表2 核桃內種皮多酚提取工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for polyphenols extraction process optimization from walnut kernel pellicle

由表2可知，各因素的影響大小為提取溫度＞乙醇體積分數＞提取時間＞液固比，云南核桃內種皮多酚的最佳提取條件為A1B2C2D1，即乙醇體積分數45%，提取時間60min，液固比60∶1（mL∶g），提取溫度70℃。

按最佳提取工藝A1B2C2D1進行驗證試驗，三次驗證試驗多酚平均得率為25.05%。

2.4 體外抗氧化試驗結果

2.4.1 對·OH的清除作用

由圖5可知，核桃內種皮多酚及VC對·OH都具有清除作用，在試驗質量濃度范圍內，隨質量濃度增加，清除率上升，清除率與質量濃度存在一定的量效關系，且核桃內種皮多酚對·OH的清除率優于VC。當核桃內種皮多酚質量濃度為160 μg/mL時，對·OH清除率可達100%。

圖5 核桃內種皮多酚對·OH的清除作用Fig.5 Effect of polyphenols from walnut kernel pellicle on·OH scavenging activity

2.4.2 對·O2-的清除作用

由圖6可知，核桃內種皮多酚對·O2-有一定的清除作用，但核桃內種皮多酚對鄰苯三酚自氧化產生的·O2-的清除作用不如VC。

圖6 核桃內種皮多酚對·O2-的清除率Fig.6 Effect of polyphenols from walnut kernel pellicle on·O2-scavenging activity

2.4.3 對H2O2的清除作用

由圖7可知，在所考察的質量濃度（5～35 μg/mL）范圍內，核桃內種皮多酚及VC對過氧化氫的清除作用隨其質量濃度的增加不斷上升，但總的來說，核桃內種皮多酚對H2O2的清除作用不如VC。

圖7 核桃內種皮多酚對H2O2的清除作用Fig.7 Effect of polyphenols from walnut kernel pellicle on H2O2scavenging activity

3 結論

核桃內種皮含有豐富的多酚類物質，核桃內種皮多酚的最佳提取條件為溫度70℃、時間60 min、液固比60∶1（mL∶g）、乙醇體積分數45%，且影響大小為：提取溫度＞乙醇體積分數＞提取時間＞液固比，在最佳提取工藝條件下，核桃內種皮多酚得率為25.05%。核桃內種皮多酚具有較強的清除羥自由基、超氧自由基及H2O2的活性，具有較好的開發應用前景。

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Optimization of extraction technology andin vitroantioxidant activities of polyphenols from walnut kernel pellicle

ZHANG Chunmei1,CHEN Chaoyin2,ZHAO Shenglan1*,HUANG Zaiqiang1,FAN Qimeng1

(1.Faculty of Chinese Traditional Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China; 2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Extraction technologyof polyphenols from walnut kernel pellicle was optimized by single-factor and orthogonal experiments.Meanwhile,the in vitroantioxidant activities of polyphenols from walnut kernel pellicle were evaluated by detecting hydroxyl radical(·OH),superoxide anion(·O2-) and hydrogen peroxide(H2O2)scavenging rates.Results showed that the optimized extraction conditions were as follows:ethanol concentration 45%, liquid-solid ratio 60∶1,temperature 70℃,and extraction time 60 min.Under such condition,the polyphenol extraction yield was 25.05%.Antioxidant experiments showed that polyphenols of walnut kernel pellicle had significant scavenging effect on·OH,·O2-and H2O2.When the polyphone concentration was 160 μg/ml,the·OH scavenging rate of polyphenols from walnut kernel pellicle was 100%,which was higher than vitamin C.

walnut kernel pellicle;polyphenols;extraction technology;antioxidant activities

R284.1

A

0254-5071（2014）07-0130-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.030

2014-05-06

科技部科技支撐計劃項目（2011BAD46B03、2011BAD46B02）；省科技計劃項目（2009EB081、2011AB006）；傣藥學、食品科學與工程學科建設項目（30970101808、3027010185）

張春梅（1989-），女，碩士研究生，研究方向為中藥資源開發與利用。

*通訊作者：趙聲蘭（1962-），女，教授，碩士，研究方向為藥食資源開發與利用。