海寧裕豐傳統(tǒng)玫瑰醋優(yōu)勢(shì)醋酸菌分離及培養(yǎng)

高澤鑫，孫曉彤，黃勛，高冰*

（1.武漢生物工程學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，湖北武漢430415；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；3.湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部，湖北武漢430068）

海寧裕豐傳統(tǒng)玫瑰醋優(yōu)勢(shì)醋酸菌分離及培養(yǎng)

高澤鑫1，孫曉彤2，黃勛1，高冰3*

（1.武漢生物工程學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，湖北武漢430415；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；3.湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部，湖北武漢430068）

以浙江海寧裕豐玫瑰醋醋醪為實(shí)驗(yàn)材料，從醋醪中分離培養(yǎng)出3株發(fā)酵性能高且菌種活力穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)醋酸菌菌株As4，Af6，Ad2。利用形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)特征和生理生化特征對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定，最后將其確定為醋酸桿菌屬中的醋化醋桿菌Ad2、巴氏醋桿菌As4和惡臭醋桿菌Af6。其中醋化醋桿菌Ad2菌株醋酸產(chǎn)量在分離菌株中最高，且在實(shí)驗(yàn)室條件下32 h內(nèi)總產(chǎn)酸可達(dá)1.02 g/mol，是可進(jìn)一步誘變提高其產(chǎn)酸率并用于生產(chǎn)的理想菌株。

玫瑰醋；培養(yǎng)；鑒定；醋酸桿菌

食醋在我國(guó)已具有兩千多年的歷史，是我國(guó)傳統(tǒng)的酸性調(diào)味品。我國(guó)傳統(tǒng)的釀造醋有鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋、福建紅曲醋、四川麩醋、北京熏醋、浙江玫瑰醋等產(chǎn)品[1]，各具特色。浙江玫瑰米醋以其天然玫瑰紅色來(lái)命名，酸味柔和綿長(zhǎng)，醋香純正，鮮而微甜，獨(dú)具風(fēng)味，是我國(guó)食醋中的佳品。該食醋不但用作調(diào)味品，而且是理想的保健食品可調(diào)配飲用。

傳統(tǒng)的玫瑰醋生產(chǎn)是以大米為原料，在浙江地理環(huán)境基礎(chǔ)下，利用環(huán)境中天然野生菌種（如醋酸菌、霉菌、酵母菌），經(jīng)表面靜置液態(tài)發(fā)酵法釀造而成的不添加任何色素、甜味劑、酸味劑，具有玫瑰紅色的釀造食醋[2-4]。生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，但環(huán)境依賴性大，由于是天然發(fā)酵，產(chǎn)品質(zhì)量容易受氣溫、濕度等環(huán)境因素的影響。因此有必要對(duì)浙江玫瑰醋的微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，并對(duì)其發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行改進(jìn)，從而改善其生產(chǎn)工藝，縮短生產(chǎn)周期[5-7]。從而提高其生產(chǎn)效率，達(dá)到增加產(chǎn)品在市場(chǎng)中的競(jìng)爭(zhēng)力與影響力的目的。

本研究以浙江玫瑰米醋作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從醋醪中分離出產(chǎn)酸效能高的優(yōu)勢(shì)醋酸菌菌株[8]，并對(duì)其進(jìn)行純化，研究其生物學(xué)特征鑒定其歸屬。這對(duì)研究浙江玫瑰醋發(fā)酵中微生物的區(qū)系分布有一定的意義[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種來(lái)源于浙江海寧裕豐釀造有限公司，從該公司玫瑰米醋醋醪中分離得到的醋酸菌菌株，現(xiàn)由武漢輕工大學(xué)生化樓409實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

醋酸菌增殖培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min，30 mL/L無(wú)水乙醇，乙醇在滅菌后培養(yǎng)基溫度降至75℃左右加入。

醋酸菌固體分離培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂粉20 g/L，碳酸鈣20 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min，30mL/L無(wú)水乙醇（滅菌后加入）。

保藏斜面培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂粉20 g/L，碳酸鈣15 g/L，pH 5.5，121℃滅菌20 min，30 mL/L無(wú)水乙醇（滅菌后加入）。

產(chǎn)酸試驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min，30 mL/L無(wú)水乙醇（滅菌后加入）。

醋酸菌種子液培養(yǎng)基：蒸餾水25 mL，葡萄糖0.25 g，酵母膏0.25 g，pH自然，121℃滅菌20 min，750 μL無(wú)水乙醇（滅菌后加入）。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖（分析純）、碳酸鈣（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LHS-250SC型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；SLY-2112B型恒溫培養(yǎng)搖床：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)：廣東瑞智科學(xué)儀器有限公司；YM50F型壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；BM2000型光學(xué)顯微鏡：南京江南永新光學(xué)有限公司；LIV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜達(dá)儀器有限公司；BL6100電子天平：德國(guó)SARTORIUS公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌純化分離試驗(yàn)流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

增殖培養(yǎng)：從玫瑰香醋醋醪中吸取1 mL原始醋醪液加入100 mL醋酸菌增殖培養(yǎng)基中放入30℃的恒溫培養(yǎng)搖床中180 r/min培養(yǎng)1 d，從而得到大量混合菌種。

光鏡觀察：用接種環(huán)從增殖培養(yǎng)基中蘸取混合液樣品到已經(jīng)滴好生理鹽水的載玻片上，輕輕攪動(dòng)讓其混合均勻，再放入顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

平板稀釋涂布[10]：吸取醋酸菌增殖培養(yǎng)基中的菌液1mL到EP管中，再通過(guò)EP管進(jìn)行依次稀釋，稀釋至1×10-6梯度。吸取1×10-4、1×10-5、1×10-6這三種梯度的EP管液各100μL加入到醋酸菌固體分離培養(yǎng)基中。涂好后將培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中30℃倒置培養(yǎng)48 h。

革蘭氏染色：挑選出溶鈣圈大，菌膜豐滿，邊緣整齊的單菌落，放置于新的固體分離培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，得到較純的醋酸菌菌種，進(jìn)行革蘭氏染色。

菌種發(fā)酵培養(yǎng)：將分離得到的不同種類的醋酸菌菌株分別放入醋酸菌種子液培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12h，再倒入200 mL產(chǎn)酸試驗(yàn)培養(yǎng)基中，30℃的恒溫培養(yǎng)搖床180 r/min培養(yǎng)2 d。

1.3.3 產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)

將分得的疑似醋酸菌菌株分別接種于醋酸菌種子液培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h后，取5 mL培養(yǎng)液，用10%NaOH將培養(yǎng)基pH值中和至中性，后加入10%氯化鐵2～3滴搖勻，形成紅褐色沉淀者為產(chǎn)醋酸菌。

1.3.4 初篩

將分得的疑似醋酸菌菌株根據(jù)革蘭氏染色和產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)篩選出革蘭氏陰性且產(chǎn)醋酸的菌株為醋酸菌。

1.3.5 產(chǎn)酸定量試驗(yàn)

將已確定為醋酸菌菌種的種子培養(yǎng)液以10%的接種量接種于產(chǎn)酸試驗(yàn)培養(yǎng)基中，30℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h，在這段時(shí)間中每2h對(duì)發(fā)酵液總酸度進(jìn)行測(cè)量?？偹釡y(cè)定方法依照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[11]。

1.3.6 菌株生長(zhǎng)曲線[12]

每隔2d取一定量的發(fā)酵液分光光度計(jì)測(cè)其波長(zhǎng)600 nm處吸光度值。測(cè)得的吸光度值再減去原始發(fā)酵培養(yǎng)基（沒加入種子液的發(fā)酵培養(yǎng)基）的吸光度值，余下的則為菌株的種子生長(zhǎng)系數(shù)。

1.3.7 優(yōu)勢(shì)菌株篩選

根據(jù)不同屬種的醋酸菌菌株產(chǎn)酸性能的高低和菌株種子生長(zhǎng)曲線進(jìn)行對(duì)比，從而選擇出優(yōu)勢(shì)的醋酸菌菌株。

1.3.8 菌株鑒定[13-14]

依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)已確定為醋酸菌的菌株進(jìn)行鑒定對(duì)比，以確定醋桿菌的屬種。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果與分析

2.1.1 光鏡下觀察結(jié)果

圖1 光學(xué)顯微鏡下的菌落形態(tài)特征(×400)Fig.1 Colony morphology characteristics of optical microscope(×400)

通過(guò)圖1可以看出，對(duì)浙江玫瑰醋初次增殖培養(yǎng)出的菌種不純，有球菌、桿菌和弧菌等。根據(jù)這種情況體現(xiàn)出傳統(tǒng)浙江玫瑰醋發(fā)酵是多種微生物參與的混合發(fā)酵，因此對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行改進(jìn)，首先要對(duì)浙江玫瑰醋的傳統(tǒng)工藝和微生物來(lái)源及演化規(guī)律進(jìn)行深入研究，這是首要的環(huán)節(jié)，也是其他各項(xiàng)工作開展的前提條件，同時(shí)也反映出對(duì)其單一傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行純化分離與鑒定的必要。

2.1.2 菌落形態(tài)特征

通過(guò)稀釋涂布的醋酸菌固體分離培養(yǎng)基生長(zhǎng)中得到的單一菌落，應(yīng)用溶鈣圈法初篩，再經(jīng)過(guò)純化分離（劃線法），最后采用梯度稀釋，將稀釋后的菌樣接種到固體培養(yǎng)基上，挑選出溶鈣圈最大的三株菌株As4、Ad2、Af6，結(jié)果見圖2。

圖2 As4、Ad2、Af6醋酸菌菌株培養(yǎng)第2天的菌落形態(tài)特征Fig.2 Colony morphology of As4,Ad2,Af6acetic acid bacteria strains on the second day cultivation

2.1.3 菌株發(fā)酵培養(yǎng)與產(chǎn)酸性能對(duì)比

將初篩選出的3株菌種分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液中總酸含量。

圖3 優(yōu)勢(shì)醋酸菌菌株的產(chǎn)酸情況Fig.3 Acid production conditions of the dominant strains

通過(guò)圖3可以看出，這三種菌株的發(fā)酵結(jié)果為Ad2菌株產(chǎn)酸量高于As4菌株和Af6菌株，由此可得出Ad2菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，對(duì)Ad2菌株用試管斜面培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)接，4℃低溫保藏備用。

2.2 菌種復(fù)篩結(jié)果與分析

2.2.1 光鏡下觀察結(jié)果

通過(guò)圖4可以看出，復(fù)篩培養(yǎng)出的Ad2菌株形態(tài)特征多為橢圓狀菌體有少許退化型特征，多為球狀和伸長(zhǎng)狀，單生或成對(duì)或成鏈生長(zhǎng)，大小為（0.6～0.7）μm×（0.9～1.5）μm，不產(chǎn)生芽孢。菌落圓形，突起，表面光滑，在含碳酸鈣的固體培養(yǎng)基上能產(chǎn)生透明圈，且菌落為肉色。

圖4 光學(xué)顯微鏡下的Ad2菌株形態(tài)特征(×400)Fig.4 Ad2strain morphology under an optical microscope(×400)

2.2.2 Ad2菌株發(fā)酵產(chǎn)酸性能與菌株生長(zhǎng)曲線

圖5 Ad2菌株種子生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of Ad2strain

圖6 Ad2菌株產(chǎn)酸情況Fig.6 Acid production condition of Ad2strain

通過(guò)對(duì)Ad2菌株進(jìn)行深層發(fā)酵，得出該菌株生長(zhǎng)的最佳活性時(shí)期是發(fā)酵前12 h，并通過(guò)對(duì)菌體OD值的測(cè)定，繪出菌株種子的生長(zhǎng)曲線見圖5。由于菌體干質(zhì)量測(cè)量經(jīng)過(guò)的步驟比較多，所受的影響也比較大，如每個(gè)三角瓶在接種時(shí)會(huì)存在一定的系統(tǒng)誤差；離心后烘至質(zhì)量恒定會(huì)受到時(shí)間、溫度以及分析天平的影響，因此該方法的準(zhǔn)確度不是很高并且工作量較大。但采用測(cè)OD值的方法可以解決這種缺點(diǎn)，而使得菌體周期的測(cè)定變得簡(jiǎn)潔和具有較高的精確度。由圖6可以看出，Ad2菌株產(chǎn)酸量隨時(shí)間增長(zhǎng)一直在穩(wěn)步上升，28 h后醋酸菌產(chǎn)酸量達(dá)到一個(gè)緩慢增長(zhǎng)的時(shí)期，32 h內(nèi)總產(chǎn)酸為1.02 g/100 mL。在食醋釀造中醋酸菌產(chǎn)酸占據(jù)了非常重要的地位，提高其產(chǎn)酸量對(duì)食醋增產(chǎn)有很大意義。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征

三株菌株的形態(tài)特征見表1，As4與Af6形態(tài)成橢圓形，Ad2的形態(tài)成短桿狀，都無(wú)芽胞。As4與Ad2排列特征為成對(duì)或成鏈，Af6為單個(gè)或成對(duì)。

表1 菌株的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristic of strains

2.3.2 菌落培養(yǎng)特征

三株菌株的單菌落特征見表2。

表2 菌株的培養(yǎng)特征Table 2 Cultural characteristic of strains

2.3.3 生理生化特征

三株菌的生理生化特征見表3。

表3 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains

2.3.4 鑒定結(jié)果

在表1～表3中所列生物學(xué)特性的前提上，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，鑒定本試驗(yàn)分離出的菌株均為醋酸桿菌屬（Acetobacter），主要依據(jù)生化反應(yīng)鑒定As4為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），Af6為惡臭醋桿菌（Acetobacter rancens），Ad2為醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）。

3 結(jié)論

本研究以浙江玫瑰米醋作為研究對(duì)象，從醋醪中分離篩選出了一株產(chǎn)酸效能高且菌種生長(zhǎng)活力旺盛的醋酸菌菌株Ad2菌株。Ad2菌種在實(shí)驗(yàn)室條件下32 h內(nèi)總產(chǎn)酸為1.02 g/100 mL。相對(duì)于在同期發(fā)酵產(chǎn)酸的As4和Af6菌株，Ad2菌株發(fā)酵性能好，是優(yōu)勢(shì)菌株。

通過(guò)生理生化鑒定，得出Ad2菌株為革蘭陰性菌，初步確定該株菌屬于醋化醋桿菌（Acetobactor aceti），該菌種嚴(yán)格好氧，適宜生長(zhǎng)溫度28～35℃，pH為5.5～6.3，酸性氧化乙醇為醋酸，產(chǎn)酸能力穩(wěn)定，且生長(zhǎng)活力旺盛。由于Ad2菌株的優(yōu)良特征，如果在后期對(duì)其進(jìn)行完整分子生物學(xué)鑒定并確定其菌株的亞種，即可進(jìn)一步誘變提高菌種產(chǎn)酸能力，讓該菌種成為可用于生產(chǎn)的理想菌株。醋酸菌代謝控制的關(guān)鍵在于適當(dāng)增加菌株代謝溶解氧、前體物和適宜的發(fā)酵溫度[15]，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整發(fā)酵條件來(lái)找到該菌株的最佳生長(zhǎng)環(huán)境。

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Separation and cultivation of dominantAcetobacter aceticfrom traditional rose vinegar in Haining Yufeng area

GAO Zexin1,SUN Xiaotong2,HUANG Xun1,GAO Bing3*

(1.Department of Biological Science&Technology,Wuhan Institute of Bioengineering,Wuhan 430415,China; 2.College of Biological and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 3.College of Light Industry,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Using rose vinegar mash in Zhejiang Haining Yufeng as experiment material,three strains of acetic acid bacteria with high fermentation performance and stable culture activity As4Af6,Ad2were separated from vinegar mash.Bacteriology identification was conducted by morphological observation,cultural characteristics,physiological and biochemical characteristics observation.In the end,Ad2was identified asAcetobacter aceti, As4asAcetobacter pasteurianus,and Af6asAcetobacter rancens.Among the three strains,Acetobacter acetiAd2had the highest acid production,and the total acid output in 32 h could reach 1.02 g/mol under laboratory conditions,it could be further induced to improve its acid production rate,and it would be an ideal strain in practice of vinegar production.

rose vinegar;cultivation;identification;Bacillus aceticus

TS201.3

A

0254-5071（2014）07-0126-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.029

2014-05-18

高澤鑫（1993-），男，本科生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵食品。

*通訊作者：高冰（1963-），男，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。