即食濕面條中腐敗微生物的分離和鑒定的初步研究

許玉慧，許喜林*，辛淑敏（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

即食濕面條中腐敗微生物的分離和鑒定的初步研究

許玉慧，許喜林*，辛淑敏
（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

為探究即食濕面條中的腐敗微生物，通過形態(tài)學鑒定，生化鑒定等手段對導致即食濕面條腐敗的微生物進行分離純化和鑒定，初步證明引起即食濕面條腐敗的優(yōu)勢微生物主要是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

即食濕面條；腐敗微生物；分離；鑒定

面條是一種源自中國，具有源遠流長歷史的食物。目前，中國市場上的面條類食品主要由三大類組成：掛面，方便面，即食濕面條（又稱保濕鮮面（long life，LL））[1]。然而，隨著工業(yè)化規(guī)模的不斷擴大，人們對營養(yǎng)要求、風味口感、方便快捷等需求的與日俱增，即食濕面條以其不脫水、營養(yǎng)衛(wèi)生、口感好、攜帶和食用方便等特點，在中國市場的發(fā)展空間將會越來越大。但是即食濕面條屬于高水分食品，容易導致腐敗微生物的滋生，因此，防止微生物的腐敗變質(zhì)是保證即食濕面條品質(zhì)的關(guān)鍵之一[2]。研究即食濕面條中的腐敗微生物十分必要。

目前，國內(nèi)外對各類面條有一定研究，周其中[2]對生鮮濕面進行研究，證明細菌和霉菌是主要的腐敗菌群，但其未對細菌屬進行鑒定。黃斌等[3]對生鮮濕面建立了危害分析和關(guān)鍵環(huán)節(jié)控制點（hazard analysis and critical control point，HACCP）系統(tǒng)，進行了危害分析并建立關(guān)鍵控制點。JENSEN N等[4]對澳大利亞多個超市出售的高濕面條中的腐敗菌群進行調(diào)查分析，結(jié)果表明主要為大腸菌群、乳酸菌、酵母菌和霉菌。然而對即食濕面條中腐敗微生物的相關(guān)報道相對較少，有李昌文等[5]對即食濕面條的保鮮研究，但其未對腐敗微生物進行分離鑒定。本研究對即食濕面條中的腐敗微生物進行分離純化，通過形態(tài)學鑒定和生化鑒定探究導致即食濕面條腐敗的優(yōu)勢微生物，從而從微生物角度控制其腐敗變質(zhì)，為即食濕面條的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

面粉：購于后勤市場，產(chǎn)自山東魯王集團有限公司。

1.1.2 試劑

30%過氧化氫溶液、靛基質(zhì)、革蘭氏染色劑、V-P試劑、硝酸鹽、吲哚等均為分析純：廣東環(huán)凱公司；氯霉素：湖北眾誠藥業(yè)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離和計數(shù)培養(yǎng)基采用營養(yǎng)瓊脂：用于細菌分離；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：用于酵母和霉菌的分離；孟加拉紅培養(yǎng)基：用于霉菌的分離；平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：用于平板計數(shù)。

生化鑒定培養(yǎng)基采用休和利夫森二氏培養(yǎng)基、V-P實驗培養(yǎng)基、硝酸鹽還原實驗培養(yǎng)基、丙酸鹽培養(yǎng)基、檸檬酸鹽實驗培養(yǎng)基、吲哚實驗培養(yǎng)基、葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基、明膠水解培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基等，按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]和《食品微生物實驗室手冊》[7]配制。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型精密pH計、MP502B型電子天平：上海精科天平公司；HY300-3型超凈工作臺：蘇凈華科凈化儀器有限公司；GZX-9070型電熱恒溫培養(yǎng)干燥兩用箱：廈門醫(yī)療電子儀器廠；HH.B11.360-S型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療機械廠；HG303-3型電熱恒溫培養(yǎng)箱：南京實驗儀器廠；H·S·G-ⅡB-4型電熱恒溫水浴鍋：上海迅大機電儀器有限公司；DragonMed型手動單道可調(diào)式移液器：上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司；XSP-3CA型單目生物顯微鏡：上海光學儀器六廠；GI36TW型全自動高壓滅菌鍋：致微儀器有限公司，BL-smart型拍擊式均質(zhì)器：北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司。

(4)政府采取的激勵無效概率為X，政府采取的激勵有效概率為1-X。購房者購買和使用普通建筑的概率為Y，購房者購買和使用被動房的概率為1-Y。如下表2所示:

1.3 實驗方法

1.3.1 即食濕面條的制作工藝流程

1.3.2 即食濕面條的微生物計數(shù)

菌落總數(shù)測定：參照GB/T 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[8]；霉菌及酵母菌測定：參照GB/T 4789.15—2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗霉菌和酵母菌計數(shù)》[9]。

1.3.3 即食濕面條中微生物的分離純化

在無菌條件下，取25 g變質(zhì)面條于裝有225 mL無菌水的無菌均質(zhì)袋中，振蕩2 min，依次作10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。及時將15～20 mL冷卻至46℃的分離培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。平板凝固后，（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h。培養(yǎng)后，挑取不同形態(tài)的單菌落，平板劃線分離，進行純培養(yǎng)。

1.3.4 即食濕面條的腐敗驗證實驗

挑取一小環(huán)所有可疑菌落加入1 mL無菌水中，制成菌懸液，依次加入煮至白芯消失的面條中，并做空白對照，放入37℃培養(yǎng)箱中，每隔12 h觀察面條的感官狀況，判定面條是否變黏稠，易斷，有酸敗味，并測定菌落總數(shù)，從而篩選出導致面條腐敗變質(zhì)的微生物。篩選出的微生物放置在4℃的冰箱中保藏，用于后續(xù)研究。

參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]采取菌落觀察、革蘭染色、芽孢染色等方法對實驗中分離得到的菌株進行初步鑒定；通過硝酸鹽還原、接觸酶、氧化酶、葡萄糖、甘露醇、木糖發(fā)酵實驗、V-P實驗、明膠水解、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、吲哚實驗、耐鹽性實驗、耐熱性等生化鑒定實驗對分離的菌株進行生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 即食濕面條微生物計數(shù)

將1.3.3中得到的稀釋液分別接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基（添加氯霉素）、孟加拉紅培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，各培養(yǎng)基中微生物的生長情況如表1所示。

表1 各培養(yǎng)基中微生物的生長情況Table 1 Growth situation of microorganisms in mediums

由表1可知，適宜細菌生長的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基微生物長較多，適宜酵母和霉菌生長的PDA培養(yǎng)基（添加氯霉素）和適宜霉菌生長的孟加拉紅培養(yǎng)基均為檢測到微生物的生長。從而得知導致面條腐敗的主要優(yōu)勢微生物是細菌。

2.2 細菌的分離純化及驗證篩選

從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑選出15個不同形態(tài)的菌落，反復劃線分離，進行純培養(yǎng)，并標記為A1、A2、A3、A4、A5；B1、B2、B3、B4、B5；C1、C2、C3、C4、C5；將篩選出的15枝菌株制成1 mL菌懸液加入新鮮即食濕面條中，12 h后觀察感官情況，對照組依然有面條的香味，顏色也無明顯變化，實驗組均出現(xiàn)面條變黏稠，易斷，顏色變黃，且有明顯的酸臭味，測得其菌落總數(shù)均超過國家標準105CFU/mL[8]。

2.3 腐敗菌的初步鑒定

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]和《食品微生物實驗室手冊》[7]，采取菌落觀察、革蘭氏染色、芽孢染色等染色方法，對實驗中分離得到的菌株進行初步觀察；通過硝酸鹽還原、接觸酶、氧化酶、葡萄糖、甘露醇、木糖發(fā)酵實驗，V-P實驗、水解明膠、水解淀粉、檸檬酸鹽、丙酸鹽、吲哚實驗、耐鹽性實驗、耐熱性等生化鑒定實驗對實驗中分離得到的菌株進行生化鑒定[11]。據(jù)初步鑒定結(jié)果，15株菌株可分為3類，A2、B3、C3、C5為一類，A3、A4、A5、B1、B4為一類，A1、B2、B5、C1、C2、C4為一類，以A1為代表類屬地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），以A2為代表類屬枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），以A3為代表類屬巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。其菌落形態(tài)特征，革蘭氏染色特征，生化鑒定結(jié)果分別見圖1、圖2及表2。

由圖1可知，A1菌落形態(tài)呈圓形，直徑2～4 mm，邊緣鋸齒狀，表面干燥，乳白色，不透明；A2菌落形態(tài)呈圓形，直徑3～5 mm，邊緣齒狀，表面隆起黏稠，乳白色，不透明；A3菌落呈圓形，直徑3～4 mm，邊緣齒狀，表面有皺褶，乳白色，不透明。

由圖2可知，15種菌株均是革蘭氏陽性菌，A1呈桿狀，長鏈狀，產(chǎn)芽孢，偏端生，橢圓形，孢囊不膨大；A2呈短桿狀，鏈狀，產(chǎn)芽孢，中生或偏端生，橢圓形或柱形，孢囊不膨大；A3呈桿狀，產(chǎn)芽孢，偏中生，橢圓形，孢囊不膨大。根據(jù)《常見細菌鑒定手冊》對產(chǎn)芽孢細菌間的鑒別，符合上述特征的有芽孢桿菌屬、脂環(huán)酸芽孢桿菌屬。

圖1 腐敗菌菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of spoilage organisms

圖2 革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Results of gram staining

表2 生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Results of physiology and biochemistry identification

由表2可知，接觸酶為陽性、硝酸鹽還原為陽性、能夠發(fā)酵利用葡萄糖，根據(jù)《常見細菌鑒定手冊》，《伯杰細菌手冊》得出這15個菌株均屬于芽孢桿菌屬，結(jié)合剩余生化鑒定結(jié)果得出以A1為代表的一類為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），以A2為代表的一類為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis），以A3為代表的一類為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

3 結(jié)論

通過對即食濕面條中腐敗微生物進行分離純化，得到15種菌株，經(jīng)過腐敗驗證實驗證明15種菌株均是導致熱制面腐敗的微生物。經(jīng)過革蘭氏染色，生化鑒定，初步判定15種菌株分為三類，以A1為代表的A1、B2、B5、C1、C2、C4為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），以A2為代表的A2、B3、C3、C5為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），以A3為代表的A3、A4、A5、B1、B4為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

目前國內(nèi)對面條的保鮮研究方面面相對狹窄，主要集中研究酸處理和添加防腐劑對生鮮面條保鮮效果的影響。劉增貴[12]以面條的酸度、口感和保質(zhì)期為指標，對酸液槽中酸液的酸度、酸洗時間、酸洗溫度三個酸洗工藝參數(shù)進行最優(yōu)化試驗，得出了酸洗的比較理想的工藝參數(shù)。此外，葉銀枝等[13]研究表明，在pH值為6.2，使用0.05%脫氫醋酸鈉防腐防霉劑，結(jié)合使用3%乳酸鈉抑菌劑一起加工生產(chǎn)出來的濕面條，在室溫30℃能保鮮24 h。黃淑霞等[14]研究了防腐劑如山梨酸鉀、尼泊金乙酯、檸檬酸等對濕生面條的保鮮作用，并得出采用復配的方法可使面條在30℃條件下保存5 d，4℃條件下保存22 d而不變質(zhì)的結(jié)論。劉增貴[12]研究了二氧化氯與雙氧水對濕生面條的保鮮研究。LEE J K等[15]就殼聚糖對生鮮濕面的防腐效果進行了研究。本研究對即食濕面條中腐敗微生物進行分離純化，得出地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌是主要優(yōu)勢腐敗微生物，進一步為面條的保鮮提供針對性措施，例如在防腐劑的選擇上，溶菌酶、乳酸鏈球菌素等天然防腐劑均對革蘭氏陽性菌起到很好的殺菌效果，適宜運用到面條生產(chǎn)。

[1]蔣志紅，吳瑩.面條類食品的現(xiàn)狀和發(fā)展[J].糧食與油脂，2003（S1）：16-19.

[2]周其中.生鮮濕面保質(zhì)保藏技術(shù)的研究[D].長沙：中南林業(yè)科技大學碩士論文，2009.

[3]黃斌，鄭曉冬，王洪成.HACCP在出口保鮮濕面生產(chǎn)中的應用[J].糧油加工，2007（7）：99-101.

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[8]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 4789.2—2010食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數(shù)測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

[9]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T4789.15—2010食品衛(wèi)生微生物學檢驗霉菌和酵母菌計數(shù)[S].北京：中國標準出版社，2010.

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[13]葉銀枝，林金鶯，王德生.濕面條的保鮮研究[J].中國食品添加劑，2002（5）：4-7.

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[15]LEE J K,LEE H J,PARK Y K.Praparation of noodle with laver powder and its characteristics[J].Korean Journal of Food Science and Technology,2000,32(2):298-305.

Separation and identification of spoilage microorganisms in instant wet noodles

XU Yuhui,XU Xilin*,XIN Shumin

(College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

To explore the major spoilage microorganisms in instant wet noodles,the methods of morphological identification and biochemical identification were used to separate,purify and identify the microorganisms that lead to spoilage in instant wet noodles.Result showed that the dominant microorganisms which leaded to the spoilage of noodles wereBacillus subtills,Bacillus licheniformisandBacillus megaterium.

instant wet noodles:spoilage microorganisms;separation:identification

TS255.1

A

0254-5071（2014）07-0068-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.015

2014--

廣東省農(nóng)業(yè)攻關(guān)科技計劃項目（2012B020311002）

許玉慧（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。

*通訊作者：許喜林（1964-），男，副教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量控制。