椰纖果發酵液中降解細菌纖維素酵母菌株的分離及鑒定

李斌，鐘春燕，王錫彬，王志國，向東*（.海南大學食品學院，海南海口5708；.海南椰國食品有限公司，海南海口5703）

椰纖果發酵液中降解細菌纖維素酵母菌株的分離及鑒定

李斌1，鐘春燕2，王錫彬1，王志國1，向東1*
（1.海南大學食品學院，海南海口570228；2.海南椰國食品有限公司，海南海口570311）

從被微生物污染的椰纖果發酵液中分離篩選出13株能夠降解細菌纖維素的酵母菌株，并對這些菌株產生的纖維素酶粗酶液進行了酶活測定。選擇羧甲基纖維素酶活（CMCA）和濾紙酶活（FPA）較高的酵母菌株3-1進行了鑒定，鑒定酵母菌株3-1為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），菌株培養液CMCA為71.48 IU，FPA為81.07 IU。

東方伊薩酵母；纖維素酶；分離；細菌纖維素

以椰子水作為生產培養基的發酵產品“椰纖果”（俗稱“椰果”或“高纖椰果”），其主要成分是細菌纖維素（bacterial cellulose，BC），纖維素通常占干質量的95%以上。由于采用淺盤靜置發酵，最終發酵得到的細菌纖維素成品通常呈膜狀，具有一定厚度，呈白色凝膠狀。細菌纖維素的結構與植物纖維素的結構一致，同屬于天然纖維素，其分子結構上與天然（植物）纖維素相同，均是D-葡萄糖之間以β-1，4糖苷鍵聚合而成[1-2]，細菌纖維素與植物纖維素的主要區別在于：無木質素、果膠和半纖維素等伴生產物，具有高結晶度（可達95%，植物纖維素的為65%）以及高的聚合度（degree of polymerization，DP）值（2 000～8 000）。從分子結構和纖維素酶催化水解纖維素的機理來看，能夠降解植物纖維素的纖維素酶也能夠降解細菌纖維素，但目前這方面的研究較少報道。

從自然界中篩選產纖維素酶的微生物菌株，較為常見的是霉菌，這些菌株已被應用生產或可為生產高活性纖維素酶提供新菌種或酶基因[3]，不同霉菌產纖維素酶的培養條件及酶學性質也有較多報道[4-7]。除霉菌外，利用細菌發酵也可生產纖維素酶，細菌分泌的纖維素酶大部分都適應中性和偏堿性的環境，對天然纖維素具有很強的分解能力，相關研究報道較多[8-11]。在菌株選育方面，文獻報道了利用紫外線和亞硝酸復合誘變進行高產纖維素酶菌株的選育，產酶性能穩定[12]。近年來利用基因重組技術獲得產纖維素酶的工程菌株成為研究熱點[13]，有文獻報道將具有纖維素酶基因的重組工程菌株定植于動物消化道內，從而提高飼料粗纖維消化率[14-15]。酵母菌通常被認為不產或極少產纖維素酶，相關報道較少，有研究者報道了從海洋微生物中篩選到一株產纖維素酶的酵母菌，具有較高的酶活力[16]。本研究從被污染的椰纖果發酵液中篩選分離出能夠降解細菌纖維素凝膠的酵母菌株，并對其中纖維素酶活力較強的菌株進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

化學試劑均為分析純：上海國藥集團；生化試劑：上海生工公司。

1.1.1 菌株

細菌纖維素凝膠生產菌株：木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001，海南大學食品綜合實驗室保藏。

細菌纖維素降解菌株：海南某椰纖果生產車間中發生污染的椰纖果發酵液中采樣。

1.1.2 培養基

細菌纖維素凝膠生產培養基：椰子水50 mL，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.2g，蔗糖3g，蒸餾水50mL，pH值自然。

菌株篩選固體培養基：羧甲基纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na）0.6 g，蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.2g，瓊脂2.0g，蒸餾水100mL，pH值自然。

菌株產酶培養基：CMC-Na 1.0 g，蛋白胨0.5 g，酵母膏0.5 g，蒸餾水100 mL，pH值自然。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫療器械有限公司；SHP-1500生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器：常州市華普達教學儀器有限公司；WFJ7200型分光光度計：上海尤尼柯實驗設備有限公司。1.3菌株的篩選與分離

1.3.1 采樣

采樣地點為海南某椰纖果生產車間，椰纖果生產方式為淺盤靜置發酵。挑選被微生物污染而發生明顯纖維素降解的發酵盤，用滅菌的移液管吸取椰纖果污染部位5 mL發酵液，裝入滅菌的空試管中備用。

1.3.2 細菌纖維素凝膠的培養

將菌株A.xylinumHN001接種于細菌纖維素凝膠生產培養基中，28℃培養2～3 d，直至液體培養基上層出現一層3～5 mm厚度的細菌纖維素凝膠薄膜。

1.3.3 降解細菌纖維素菌株的篩選與分離

將1.3.1采樣獲得的發酵液做系列稀釋梯度100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分別涂布篩選平板，平板采用1.1.2中所述的菌株篩選固體培養基。倒置恒溫28℃培養2 d，分離出能夠旺盛生長的菌株，將菌株編號，用接種環挑取少許菌體涂布于1.3.2中所獲得的細菌纖維素凝膠薄膜表面，培養觀察2～3 d，若發現細菌纖維素凝膠膜出現明顯的降解，則證明該菌株能夠產生纖維素酶，并具有降解細菌纖維素的能力。

1.4 酶活的測定

篩選出的菌株用1.1.2所述的菌株產酶培養基培養5 d，粗酶液采用國際理論與應用化學聯合會（internationalunion of pure and applied chemistry，IUPAC）推薦的方法[17]來測定濾紙酶活（filter paper activity，FPA）和羧甲基纖維素酶活（carboxyl methyl cellulose enzyme activity，CMCase）。酶活力單位用國際單位IU來表示，纖維素酶酶活力單位的定義：在酶的催化下，每分鐘形成1 μmol葡萄糖時所用該酶的量為1個酶活國際單位（IU）。

1.5 菌株的鑒定

篩選出纖維素酶活力較高的菌株，委托中國科學院微生物研究所進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 菌株的采樣

從海南某椰纖果廠生產車間中挑選出被微生物污染的細菌纖維素凝膠，圖1為凝膠表面部分纖維素被降解，表面出現空洞狀，圖2凝膠完全被降解，呈液體狀。圖1和圖2表明在污染椰纖果細菌纖維素凝膠的微生物中，存在能夠產生纖維素酶的微生物，導致細菌纖維素發生降解。按照1.3.1所述的方式進行采樣，可以篩選出產纖維素酶的微生物菌株。

圖1 部分被降解的細菌纖維素Fig.1 Partly degraded bacterial cellulose

圖2 全部被降解的細菌纖維素Fig.2 Completely degraded bacterial cellulose

2.2 篩選和分離

按照1.3.3所述的方法對菌株進行篩選和分離，共篩選分離出13株能夠產纖維素酶的菌株，分別編號為1-1；1-2；1-3；2-1；3-1；3-2；3-3；4-1；4-2；4-3；5-1；5-2；5-3，通過顯微鏡觀察，發現這些菌株均為酵母菌。這些菌株的菌體涂布于1.3.2所述的細菌纖維素凝膠膜表面，均能對細菌纖維素進行降解。

2.3 酶活測定

2.3.1 羧甲基纖維素酶活力測定

對篩選出的13株酵母按1.1.2中的產酶培養基進行產酶培養，離心分離后測定其上清液CMC酶活力，結果發現各株酵母培養液均有一定CMC酶活，但差異較大，由圖3可知，1-2酵母菌株培養液CMC酶活性較高。

圖3 菌株發酵液CMC酶活Fig.3 CMCA of strain fermentation broth

2.3.2 濾紙酶活力的測定結果

對篩選出13株酵母按1.4中的方法進行產酶培養后，離心分離后測定其上清夜FPA酶活力，結果發現各株酵母培養液均有一定FPA酶活，如圖4所示。由圖4可知，3-1，1-3酵母菌株培養液FPA酶活性較高。

圖4 菌株發酵液濾紙酶活Fig.4 FPA of strain fermentation broth

從上述13株酵母菌選擇CMC酶活及FPA酶活都相對較高的菌株3-1，委托中國科學院微生物研究所進行鑒定。

2.4 菌株的鑒定

2.4.1 培養和顯微形態特征

麥芽汁液體培養基中25℃培養3 d，細胞球形、臘腸形，大小為（3.6～10.8）μm×（2.4～6.0）μm，有沉淀形成。麥芽汁瓊脂斜面25℃培養30 d，菌落奶酪狀，乳白色，表面平滑，不反光，邊緣須狀。玉米粉瓊脂Dalmau平板培養，產生假菌絲。菌株3-1顯微形態如圖5所示。

圖5 酵母菌株3-1顯微形態Fig.5 Morphology of yeast strain 3-1

2.4.2 理化特征

由表1可知，菌株3-1可發酵葡萄糖，但不能發酵麥芽糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、棉子糖等其他糖類，碳源只能同化琥珀酸及檸檬酸，不能同化其他碳源，這表明本菌株可利用的碳源范圍較窄，在培養環境中出現碳源缺乏時，可產生纖維素酶對纖維素進行降解，使之產生能夠利用的葡萄糖單元。

2.4.3 rRNA基因ITS區序列測定

通過rRNA基因ITS區序列，結果如下：

GTCTCGCAACACTCGCTCTCGGCCGCCAAGCGT CCCTGAAAAAAGTCTAGTTCGCTCGGCCAGCTTCGC TCCCTTTCAGGCGAGTCGCAGCTCCGACGCTCCTTT ACACGTCCGCTCCCCCAACTCTGCGCACGCGCAAGA TGGAAACGACGCTCAAACAGGCATGCCCCCCGGAA TGCCGAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAGAACTCGAT GATTCACGATGGCTGCAATTCACACTAGGTATCGCA TTTCGCTGCGCTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAG ATCCGTTGTTGAAAGTTTTGTTTGTTTTTCGTAGATT TCTCTTGTCGACTATATTCCACATTTTAGGTGTTGTT GTTTTCGTTCCGCTCACGCAGTCTAGTACTAAATCA CAGTAAGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACC TTGTTACGAC。

根據上述鑒定結果，最終鑒定菌株3-1為一株東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。

3 結論

海南自1997年開始，利用豐富的椰子水資源作為培養基，以木醋桿菌為菌種生產細菌纖維素凝膠（又稱椰纖果），采用淺盤方式培養，生產周期為4～7 d。目前年生產能力近30萬t，產值超過10億元，是近年來海南新興的食品工業的支柱產業，纖維素凝膠的主要成分為纖維素，凝膠干質量中99%都為纖維素。而由于生產技術不成熟，雜菌污染嚴重，損失約占總產量的40%～50%。經調查研究表明，造成細菌纖維素凝膠生產損失的微生物有酵母、霉菌和細菌。而其中能造成毀滅性破壞的只有酵母菌，約占總損失量的90%。一盤300 g的椰纖果細菌纖維素凝膠48 h就可以被酵母菌降解為液體，這與相關報道酵母菌很少產酶或不產酶十分矛盾。

本研究篩選的一株東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）在產酶培養液中培養5d，測定的CMC酶活達71.48IU，FPA濾紙酶活達81.07IU，離心后的清液干質量為4%，如按干質量計算CMC酶活達2026.75IU，FPA酶活達1167.5IU。而產酶較高的木霉的CMC酶活在1 200～1 800 IU，FPA濾紙酶活在300～600 IU左右。由此可知，酵母產酶活性可與目前產酶量最高的木霉相媲美，與目前市售纖維素酶試劑相當。本研究證明一些酵母菌在特定條件下，能大量地產生纖維素酶，而且具有較高的酶活力。酵母菌安全性高，而且具有酶的外分泌性和產酶量高的特點，高產纖維素酶酵母的發現，必將對纖維素酶的研究與利用產生重大的影響。

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Isolation and identification of yeast strains fromnata decoco fermentation broth for degrading bacterial cellulose

LI Bin1,ZHONG Chunyan2,WANG Xibin1,WANG Zhiguo1,XIANG Dong1*
(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China; 2.Hainan Yeguo Foods Co.,Ltd.,Haikou 570311,China)

From fermentation broth of polluted natade coco,13 yeast strains for degrading bacterial cellulose were isolated and the filter paper activity (FPA)and carboxyl methyl cellulose enzyme activity(CMCA)in crude fermentation broth were measured.The yeast strain 3-1 was chosen based on its higher FPA and CMCA,and it was identified asIssatchenkia orientalis.The CMCA and FPA of the strain 3-1 fermentation broth were 71.48 IU and 81.07 IU,respectively.

Issatchenkia orientalis;cellulase;isolation;bacterial cellulose

Q93-335

A

0254-5071（2014）07-0051-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.011

2014-04-01

海南省自然科學基金（312076）

李斌（1966-），男，實驗師，專科，研究方向為食品發酵工程及食品分析。

*通訊作者：向東（1976-），男，副教授，碩士，研究方向為食品科學及食品發酵工程。