響應面法優化米曲霉產孢工藝條件

張義偉，劉瑞勇，李新銳，劉旭博，張良*（沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧沈陽110866）

響應面法優化米曲霉產孢工藝條件

張義偉，劉瑞勇，李新銳，劉旭博，張良*
（沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧沈陽110866）

米曲霉（Aspergillus oryzae）是一種在食品中應用廣泛的真菌。為了得到較多的米曲霉孢子，基于單因素試驗選取了培養溫度、培養基含水量和接種量3個因素，利用Design-Expert響應面分析法對產孢進行了優化。結果表明，在培養溫度為22.66℃，培養基含水量為48.79%，接種量為3.44‰時，產孢子數預測可達到12.743 7×109CFU/g，實際測得為12.1×109CFU/g，達到預測值的94.95%。

米曲霉；孢子粉；響應面優化

米曲霉（Aspergillus oryzae）是一種好氣性真菌，屬于半知菌亞門、曲霉屬。菌絲一般在酸度較大的培養基上呈綠色，在酸度較小的培養基上呈黃色，老化后逐漸為褐色[1]。其分生孢子梗生長在厚壁的足細胞上，產生的分生孢子頭呈放射形，頂囊球形或瓶形。米曲霉具有豐富的蛋白酶系，能產生酸性、中性和堿性蛋白酶，它的穩定性很高，可以耐受高溫，主要存在于糧食、發酵食品、腐敗有機物、土壤等處。米曲霉也是美國食品與藥物管理局和美國飼料公司協會1989年公布的40余種安全微生物菌種之一[2]。

目前，在醬及醬油的工業化生產中普遍使用米曲霉作為發酵菌株[3]。在發酵制醬的過程中，米曲霉產生的蛋白酶系可以將含有豐富蛋白質、鈣、磷、鐵等營養物質的大豆[4-5]酶解，促使豆中的磷、鈣等礦物質被釋放出來，提高人對大豆中礦物質的吸收率，制得的大醬營養比大豆更易于消化吸收[6-7]，具有良好的抗血栓、抗氧化、抗病勞、抗癌等生理作用[8-9]。且若利用米曲霉孢子粉[10]代替傳統的自然發酵中產生的微生物還可彌補傳統大醬釀造方法周期長的不足。

因此，高效生產米曲霉孢子粉具有工業價值，可以為尋找周期短、成本低、產量大的產孢條件提供依據，增強工業競爭實力。本研究選取了培養時間、培養溫度、培養基含水量和接種量進行單因素試驗，再利用基于統計學方法[11]的Design-Expert響應面法[12-15]對米曲霉產孢條件進行優化，確定了米曲霉產孢子的最佳工藝條件。為快速發酵產孢子生產提供了新思路，將為米曲霉研究的發展提供理論及技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

米曲霉滬釀3.042：武漢佳成生物制品有限公司提供。

1.1.2 培養基

麩皮、稻殼、玉米粉：均購自于市場，培養基中麩皮∶稻殼∶玉米粉=6∶1∶1.2。

1.1.3 試劑

無水乙醇（分析純）、硫酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

JK-HI-9012恒溫培養箱、JK-PSPS-18L高壓蒸汽滅菌鍋：上海精科儀器公司；FA2004A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；GH-HZT電子天平：上海貴虎實業發展有限公司；XB.K.25血球計數板：上海市求精生化試劑儀器有限公司；XSP-8CA顯微鏡：上海上光新光學科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米曲霉孢子粉的制備

按麩皮∶稻殼∶玉米粉=6∶1∶1.2的比例進行培養基的配制[16]。放入高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min，冷卻至室溫后進行米曲霉孢子粉的培養[17-18]。分成四大組：第一組以培養時間為自變量，加水量均為培養基總質量的55%，接種量均為總質量的3‰，培養溫度均為20℃，每天觀測產孢子的數量，直至第9天為止；第二組以培養溫度為自變量，分別取20℃、21℃、21.5℃、22℃、22.5℃、23℃、23.5℃共7個溫度梯度，其他條件均相同，培養5 d觀測產孢子數；第三組以培養基含水量為自變量，選取培養基總量的45%～70%間6個含水量梯度進行試驗，每個梯度相差5%，孢子粉接種量均為總質量的3‰，培養溫度為20℃，5 d后觀察產孢情況；第四組以接種量為自變量（1.5‰、2.0‰、2.5‰、3.0‰、3.5‰、4.0‰），培養溫度20℃，含水量50%，培養5 d后計算產生孢子數量。

1.3.2 單因素試驗

分別以培養時間、培養溫度、培養基含水量、培養基接種量為單因素變量，以產孢量為指標進行試驗。

1.3.3 產孢條件的優化

根據單因素試驗的結果，選取培養溫度、培養基含水量、接種量為自變量設定試驗的因素和水平值見表1，以產孢量為響應值，利用Box-Behnken中心組合試驗設計原理[19-21]設計響應面分析試驗。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3.4 產孢量的測定

（1）不同稀釋度的孢子懸浮液制備

精確稱取培養基（樣品）0.100 0 g，倒入盛有玻璃珠的250 mL錐形瓶內，加體積分數為95%的酒精5 mL，加無菌水20 mL，加稀硫酸（10%）10 mL，充分振搖，使分生孢子充分分散，然后用4層紗布過濾、沖洗，使濾渣不含孢子，之后加水65 mL稀釋至100 mL，在其中取出1 mL加至9 mL水中，使孢子懸液稀釋至1 000倍。

（2）孢子數測定

取擦拭干凈的血球計數板蓋上蓋玻片，將稀釋的孢子懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，孢子懸液利用液體的表面張力充滿計數區，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余孢子懸液。靜置數分鐘，待孢子沉降。

（3）孢子數計算

采用ZBX66028—87《孢子數測定法》[22]計算孢子數。使用血球計數板，選四角及中間共5大格為計數區，得到的孢子數值為n，孢子數計算公式如下：

式中：n為血球計數板中5個大格中的總孢子數，個；G為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 培養時間對產孢的影響

培養時間是影響產孢量的重要因素之一。培養溫度、培養基含水量培養基接種量均相同，培養時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d，得到如圖1所示產孢曲線。由圖1可知，隨著培養時間的延長，米曲霉的菌絲逐漸生成增多，培養基營養被逐漸利用，米曲霉的孢子數也在逐漸增加；培養至6 d左右，由于菌絲生長量一定，產孢量也趨于穩定。繼續延長時間菌絲生長量不再增加，產孢量也不再有明顯增加。因此，培養時間選擇為6 d。

圖1 培養時間對產孢量的影響Fig.1 Effect of fermentation time onA.oryzaespores production

2.1.2 培養溫度對產孢的影響

培養溫度會影響米曲霉菌絲的生長繁殖，從而會影響最終的產孢量。要得到大量的米曲霉孢子粉，控制合適的培養溫度非常重要。分別在20℃、21℃、21.5℃、22℃、22.5℃、23℃、23.5℃共7個溫度條件下進行試驗，得到的產孢量曲線如圖2所示。由圖2可知，培養溫度在20～22.5℃時，隨著溫度的升高，米曲霉菌絲生長繁殖逐漸加快，產孢量也逐漸增加，當培養溫度達到22.5℃時，產孢量達到峰值；但當培養溫度＞22.5℃時，產孢量呈下降趨勢，原因是培養溫度升高對菌絲生長繁殖不利所致。故培養溫度選擇22.5℃比較合適。

圖2 溫度對產孢量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature onA.oryzae spores production

2.1.3 培養基含水量對產孢的影響

水分多少直接影響著米曲霉的產孢量，米曲霉利用培養基中的水分進行生長繁殖，適宜的水分有利于菌絲的生長，從而提高孢子粉的產量。在其他條件不變，含水量分別為45%、50%、55%、60%、65%、70%的情況下得到的產孢曲線如圖3所示。由圖3可知，培養基含水量為50%時產孢量最多，含水量＜50%時，培養基中水的活度會降低，酶的活性也會減小，菌絲生長繁殖受限，從而影響最終的產孢量；含水量＞50%時，培養基濕度較大，質地較密實，氧氣含量也少，不利于產孢。所以只有選擇合適的培養基的含水量才會得到理想的產孢效果，而且隨著發酵的進行，培養基內水分逐漸蒸發，其條件更有利于產孢。所以含水量選擇50%為宜。

圖3 含水量對產孢量的影響Fig.3 Effect of medium water content onA.oryzae spores production

2.1.4 接種量對產孢的影響

接種量分別為1.5‰、2.0‰、2.5‰、3.0‰、3.5‰、4.0‰，對產孢量影響的曲線如圖4所示。由圖4可知，在接種量＜3.0‰的范圍內，隨著接種量的增多，菌絲生長量也會逐漸增多，產孢量也會隨之增加；接種量在3.0‰時可得到產孢量的峰值；接種量＞3.0‰，菌絲的生長也會隨之增加，這時，由于培養基營養條件有限，菌絲主要利用營養物質進行其代謝活動，代謝的同時還會進行二氧化碳的釋放，更不利于米曲霉進行繁殖積累孢子。因此，接種量選擇3.0‰為宜。

圖4 接種量對產孢量的影響Fig.4 Effect of inoculum onA.oryzaespores production

2.2 米曲霉產孢最佳工藝參數的確定

在單因素試驗的基礎上，以產孢量為考察指標，選取培養溫度（℃）、培養基含水量（%）、接種量（‰）3個因素，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用3因素3水平的響應面分析方法進行試驗對米曲霉產孢條件進行優化，試驗設計及結果見表2。采用Design-Expert統計軟件對試驗結果進行響應面回歸分析，回歸方程的方差顯著性分析結果見表3。

表3 響應面二次回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for response surface quadratic regression model

結果顯示，R2=0.987 1，說明回歸方程的擬合度較好，經過回歸擬合后，培養溫度（A）、培養基含水量（B）和接種量（C）對產孢量（Y）的影響回歸方程：Y=11.8+1.09A-1.48B+ 2.36C-1.15AB+1.87AC-0.3BC-3.42A2-4.1B2-3.42C2。

米曲霉產孢量模型極顯著（P＜0.01），其決定系數R2=0.987 1，說明本試驗所選的因素之間存在著顯著的回歸關系，用此模型可以預測產孢量（Y）對培養溫度（A）、培養基含水量（B）和接種量（C）3個因素的響應值。

由表3可知，模型的一次項A、B、C極顯著，交互項AB顯著、AC極顯著、BC不顯著，二次項A2、B2、C2極顯著，因此各個具體試驗因子與響應值都不是簡單的線性關系。

根據上述模型進行響應面和等高線作圖，培養溫度（A）、培養基含水量（B）和接種量（C）與產孢量之間的關系見圖5。由圖5可知，培養溫度（A）、培養基含水量（B）和接種量（C）存在極值點，在此條件下測得的產孢量達到12.1×109CFU/g，與預測值（12.743 7×109CFU/g）十分接近，表明預測值和實際值有很好的擬合性，驗證了模型的可靠性。由Design-Expert響應面分析軟件RSM分析得到米曲霉產孢最佳條件是培養溫度為22.66℃、培養基含水量為48.79%、孢子粉接種量為3.44‰。在這種情況下培養基所得孢子數預測可達到12.743 7×109CFU/g。本試驗對實際生產控制條件綜合對比得到最佳產孢條件為培養溫度為23℃、培養基含水量為50%、接種量為3.5‰。

圖5 各因素交互作用對米曲霉產孢量的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour line of interaction among each factors onA.oryzaespores production

3 結論

響應面方法是優化米曲霉產孢條件的有效工具，Box-Behnken試驗設計能建立主要因素影響米曲霉產孢的二次多項數學模型，并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，優化了內在因素水平，可以找出最佳值。經過優化后，在培養溫度為22.66℃、培養基含水量為48.7%、接種量為3.44‰時，產孢量預測可達到12.743 7×109CFU/g，實際測得為12.1×109CFU/g，達到預測值的94.95%。

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Optimization ofAspergillus oryzaespores-producing process condition by response surface analysis

ZHANG Yiwei,LIU Ruiyong,LI Xinrui,LIU Xubo,ZHANG Liang*

(College of Biological Science&Technology,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Aspergillus oryzaeis widely used in food.In order to get more spores ofA.oryzae,based on single factor test,three factors of culture temperature,medium water content and inoculums were selected to conduct response surface analysis to optimize spores production fromA.oryzae.The results showed that under the condition of temperature 22.66℃,medium water content 48.79%,inoculum 3.44‰,the predicted spores were up to 12.743 7×109CFU/g,and the actual detected number was 12.1×109CFU/g,reaching 94.95%of the predicted value.

Aspergillus oryzae;spores;response surface optimization

Q815

A

0254-5071（2014）07-0034-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.007

2014-05-09

國家科技部“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD31B05-3）；沈陽農業大學大學生科技創新項目（201310157539）

張義偉（1989-），女，本科生，研究方向為微生物與酶工程。

*通訊作者：張良（1979-），男，講師，博士，研究方向為生物工程。