HPLC法測定鼻康合劑中綠原酸的含量

柯昌毅，謝鳳英，謝劍鋒，李 揚（重慶市第三人民醫院，重慶 400014）

蒼耳子系菊科植物蒼耳Xanthium sibiricumPart.的干燥成熟帶總苞的果實[1-2]，為中醫臨床常用藥，始載于《神農本草經》，具有散風除濕、通鼻開竅的功效，用于治療風寒頭痛、鼻淵流涕、風疹瘙癢和濕痹拘攣等證[3-5]。我院以蒼耳子為主藥，制備成鼻康合劑，用于治療急、慢性鼻炎及副鼻竇炎，效果較好。由于蒼耳子的主要活性成分為酚酸類化合物[6]，其中綠原酸為主要成分[7]，故本試驗建立了以高效液相色譜（HPLC）法測定鼻康合劑中綠原酸含量的方法[8-9]，旨在為該制劑的質量標準研究以及用藥安全提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，含四元泵、1260型化學工作站（美國安捷倫公司）；AR224CN型萬分之一電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；UV-2450型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

鼻康合劑（重慶市第三人民醫院制劑室，批號：20120509、20120510、20120511）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200413，供含量測定用）；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為注射用水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[1]與系統適用性試驗

色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）；流動相：0.5%磷酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～20 min，80%A→60%A；＞20～50 min，60%A→50%A；＞50～60 min，50%A→80%A）；檢測波長：327 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。理論板數按綠原酸峰計算應不低于3 000；綠原酸與相鄰雜質峰的分離度＞1.5。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品10.41 mg，置100 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，即得質量濃度為104.10 μg/ml的對照品貯備液，搖勻，備用。精密量取對照品貯備液2 ml，置5 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為?41.64 μg/ml的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取鼻康合劑（批號：20120509）2 ml，置于25 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察

精密量取綠原酸對照品貯備液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml，分別置于10 ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度分別為5.20、10.41、20.82、41.64、62.46 μg/ml的系列對照品溶液。分別取上述溶液按“2.1”項下色譜條件進樣分析，進樣量為20 μl。以對照品溶液質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.013 5x－0.304 7（r＝0.999 9，n＝5）。結果表明，綠原酸質量濃度在5.20～62.46 μg/ml范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取綠原酸對照品溶液（41.64 μg/ml）20 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，重復進樣5次，測定峰面積。結果顯示，綠原酸的平均峰面積積分值為1 874.4，RSD＝0.74%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液（批號：20120509）適量，室溫下放置12 h，分別于0、2、4、6、8、10、12 h按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積。結果顯示，綠原酸的平均峰面積積分值為1 802.0，RSD＝0.16%（n＝7），表明室溫條件下供試品溶液在12 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取鼻康合劑樣品（批號：20120509）適量，共6份，精密量取，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算樣品含量。結果顯示，6份樣品中綠原酸的平均質量濃度為0.303 0 mg/ml，RSD＝1.34%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已測定質量濃度（0.303 0 mg/ml）的同一批（批號：20120509）樣品9份，各1.0 ml，每3份為一組，分別按低、中、高質量濃度精密加入適量綠原酸對照品貯備液，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測定

分別精密量取3批鼻康合劑各2 ml，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，以峰面積計算樣品中綠原酸的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

在檢測波長的選擇中，取綠原酸對照品10 mg，置50 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 ml含綠原酸10 μg的溶液。照分光光度法[2]測定，以50%甲醇為空白對照，在波長200～400 nm波長范圍內掃描，可得綠原酸在327 nm波長處有較強吸收（吸光度為0.558），故確定檢測波長為327 nm。紫外掃描曲線見圖2。

圖2 對照品在波長200～400 nm范圍內的紫外掃描曲線Fig 2 Scanning absorption curves of substance control in the wavelength range of 200-400 nm

在流動相的選擇中，筆者主要考察了甲醇-磷酸系統和乙腈-磷酸系統對色譜峰的影響。結果表明，甲醇-磷酸系統的分離效果較好，因此選擇甲醇-0.5%磷酸溶液為流動相，進行梯度洗脫。

綜上所述，本方法簡單、準確、重復性好，可用于鼻康合劑的質量控制。

[1]中國科學院《中國植物志》編輯委員會.中國植物志：第75卷[M].北京：科學出版社，1985：324.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：151、附錄30.

[3]姜蕭，隋進江.淺談中藥蒼耳子毒性及中毒的搶救方法[J].黑龍江中醫藥，2000，20（4）：63.

[4]李華，張春玲.蒼耳子的臨床應用概述[J].吉林中醫藥，1993（3）：45.

[5]劉玉紅，郝震峰.蒼耳子化學成分及藥理作用研究進展[J].山東醫藥工業，2003，22（1）：22.

[6]韓婷，李慧梁，胡園，等.蒼耳子中酚酸類化合物及不同品種和居群蒼耳子中總酚酸含量的測定[J].中西醫結合學報，2006，4（2）：194.

[7]邱玉玲，代英輝，王東，等.蒼耳子的化學成分[J].中國藥物化學雜志，2010，20（3）：214.

[8]明乾良，高翔，張宏，等.用HPLC法測定不同地區三種蒼耳子中綠原酸的含量[J].藥學服務與研究，2008，8（4）：258.

[9]楊柳，吳金雄，許舜軍，等.蒼耳子中酚酸類化合物的鑒別及綠原酸的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（19）：85.