骨髓間充質干細胞移植治療兔深靜脈血栓的實驗研究

孔祥騫，孫 巖，金 星，董典寧，袁 海，周 華，吳學君

骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一種多能干細胞，具有干細胞的共性即自我更新及多向分化的能力，可分化成骨、軟骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基質等中胚層組織［1-10］。自1968年Friedenstein等［11］發現BMSCs具有多向分化潛能以來，其便成為血管新生研究的熱點。下肢深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)是一種臨床常見病、多發病，發病率達100/10萬，盡管采用抗凝、溶栓以及經導管溶栓或手術取栓等多種方法治療，療效仍不理想，后期許多患者出現肢體疼痛腫脹、小腿潰瘍、行走困難等癥狀，患者承受巨大痛苦，給其家庭和社會造成沉重負擔［12-13］。研究表明，血栓后遺癥的發生與血液回流是否通暢，即與血栓再通程度密切相關［14］。故而如何采用更為有效的治療方法促進血栓的再通成為當前研究的熱點。鑒于干細胞的多能性，筆者所在科室設想通過將BMSCs移植到兔下腔靜脈血栓模型中，觀察其是否加速血栓的機化與再通，為DVT的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔40只，體重約2．5 kg，購自山東省農業科學院實驗兔場［許可證:SCXK(魯)2009-0001］。

1.2 主要試劑 胎牛血清、無血清培養液購自GIBCO公司;淋巴細胞分離液購自濟南科瑞公司;凝血酶購自蘇州新寶制藥有限公司;羊抗兔血管內皮細胞生長因子(VEGF)-C單克隆抗體、鼠來源血管性血友病因子(vWF)多克隆抗體、鼠抗兔堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)多克隆抗體購自武漢博士德公司;青霉素購自山東魯抗醫藥股份有限公司;山羊IgG二抗、驢IgG二抗購自廣州中杉公司;戊巴比妥鈉購自深圳市騰龍源實業有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組:40只新西蘭大白兔中8只作為干細胞供體，余32只建立血栓模型，成功后隨機分為4組，每組8只。A組:建模3 d后，將含有107個BMSCs的DMEM懸液1 ml移植于股靜脈中;B組:建模3 d后，將1 ml 0．9%氯化鈉注射液注入股靜脈內;C組:建立血栓模型10 d后，將含有107個BMSCs的DMEM懸液1 ml移植于股靜脈中;D組:建立血栓模型10 d后，將1 ml 0．9%氯化鈉注射液注入股靜脈內。

1.3.2 BMSCs的分離、體外培養及鑒定:8只干細胞供體大白兔采用2．5%戊巴比妥鈉以1 ml/kg劑量于兔耳緣靜脈麻醉后，用聚維酮碘消毒術區3遍，于兔股骨下端行骨髓穿刺，用10 ml注射器(預置25 U/ml肝素鹽水1 ml)抽取骨髓3～10 ml，可根據情況調整骨髓穿刺針的進針深度和方向。將其加入肝素預凝的無菌離心管中，再加入等量無血清培養液懸浮細胞。將上述懸液小心加在等量1．073 g/ml的淋巴細胞分離液上，室溫下1000 r/min離心20 min，懸液分為4層，吸取中間的白膜層，用含血清的培養液進行懸浮，室溫下1000 r/min離心5 min，去上清，重復清洗2次，獲得較純凈的BMSCs。培養擴增并進行干細胞鑒定，首先鏡下觀察細胞形態及細胞貼壁生長的特性，當細胞生長至80%～90%后，制成單細胞懸液，1000 r/min離心5 min。收集細胞沉淀，洗滌后分別加入熒光標記的抗體。40℃孵育30 min，PBS洗滌，多聚甲醛固定后用流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD11b、CD29、CD44、CD45 的表達［15］。

1.3.3 血栓模型的建立:4組大白兔麻醉成功后，將其仰臥固定于手術臺上，嚴格無菌操作，于腹正中線做一長約6 cm的縱向切口，保護腸管，游離顯露腎靜脈水平以下的下腔靜脈約1．5 cm，上下端以7#絲線結扎。將凝血酶配制成100 U/ml溶液，用1 ml注射器向結扎靜脈段內注入10 U(0．1 ml)，觀察20～30 min，確認血栓形成(血管由紅色變為暗紅色)后，遠端拆除結扎線，近端將結扎線松開后再輕輕結扎，使近端下腔靜脈狹窄，防止血栓脫落，并作為取材標記。檢查無異常后，縫合腹部切口。

1.3.4 BMSCs移植方法:麻醉成功后，于兔股部做一長約1 cm的縱向切口，游離顯露股靜脈，穿刺靜脈注入1 ml BMSCs懸液，移植后按壓止血，依次縫合各層組織。

1.4 觀察項目

1.4.1 新生毛細血管形態觀察及計數:移植后第14、28天，每組隨機取4只兔，過量麻醉處死，取病變段下腔靜脈，甲醛固定后做石蠟切片，行HE染色、vWF免疫組化檢查。鏡下計數每5個高倍視野新生毛細血管數，相同高倍視野下分別由3位檢驗醫師計數，取平均值。

1.4.2 血栓中VEGF、bFGF蛋白表達的檢測:移植后第14天，每組隨機取4只兔，過量麻醉處死，取下腔靜脈段血栓，應用Western blot法檢測血栓中VEGF、bFGF蛋白的表達，以 β-肌動蛋白(β-actin)為參照物。

1.5 統計學方法 應用SPSS 13．0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用方差分析、q檢驗，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 新生毛細血管形態觀察及計數比較 移植后對兔石蠟切片行HE染色可見新生毛細血管內紅細胞被染成紅色，vWF免疫組化染色可見新生毛細血管壁呈棕褐色，據此可以觀察新生毛細血管。A、C組移植后14 d可見有新生毛細血管形成，以C組更明顯;移植后28 d，4組均見有新生毛細血管生成，A、C組新生血管腔隙較B、D組明顯增大。A組鏡下可見較多棕褐色新生毛細血管，但管腔較小，血栓機化再通較明顯;C組可見大量新生毛細血管，且管腔大，血栓機化再通明顯;B、D組鏡下可見少量新生毛細血管，管腔變化不明顯，且新生血管多集中在血栓周邊，靠近管壁。A、B、C、D組移植后14 d每5個高倍視野新生毛細管數分別為(78．57±10．64)、(43．57 ± 5．38)、(94．00 ± 7．67)、(58．53 ± 6．87)條，移植后28 d 分別為(118．00 ±12．53)、(66．32 ±4．65)、(138．00 ± 12．69)、(74．23 ± 8．38)條，A、C組多于B、D組(P＜0．05)，C組多于 A組(P＜0.05)，B組與D組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 VEGF、bFGF蛋白的表達 Western blot檢測結果顯示，各組 VEGF、bFGF蛋白均有表達，A組VEGF、bFGF蛋白水平高于 B 組(P＜0．05)，C 組VEGF、bFGF蛋白水平高于 D 組(P ＜0．05)，B、D 兩組比較差異無統計學意義(P＞0．05)，見圖1、2和表1。

3 討論

DVT是一種常見靜脈疾病，不僅可引發肺栓塞，而且疾病后期可并發下肢慢性靜脈功能不全(CVI)，表現為肢體腫脹、疼痛、潰瘍形成等癥狀。30% ～67%髂、股靜脈內存在大量血栓的患者，病后3～8年內會出現嚴重的CVI癥狀，而且未徹底治愈的DVT并發CVI患者的臨床癥狀要比單純靜脈瓣膜功能不全患者表現出的倒流性疾病癥狀更加嚴重［16］。

血栓后遺癥的發生與血液回流是否通暢即血栓再通程度有密切關系。血栓的機化和再通是由多種細胞和細胞因子參與的動態過程。盡管目前已經進行了長期大量的基礎及臨床研究［17-20］，血栓機化和再通的具體機制仍未完全闡明。近年研究發現BMSCs在血栓機化再通過程中發揮著重要的作用。Mizuno等［21］用一個不透膜把栓子和血管壁隔開，一定時間后血栓內的裂隙仍可見內皮細胞覆蓋，機化同樣會發生。Feigl等［22］用可滲透膜包裹血栓后放入血管中，防止其與血管壁接觸，血栓內部同樣會發生內皮化和再通。以上實驗從側面說明血栓中再通管道的內皮細胞不只來自血管壁，還可能來自循環血液中的內皮祖細胞(EPCs)。Moldovan［23］對間充質干細胞(MSCs)在靜脈血栓再通中的作用進行綜述，發現增加單核細胞或EPCs能夠加速血栓再通。

圖1 兔骨髓間充質干細胞移植后第14天各組血管內皮細胞生長因子的表達

圖2 兔骨髓間充質干細胞移植后第14天堿性成纖維細胞生長因子蛋白的表達

表1 兔骨髓間充質干細胞移植后第14天各組VEGF、bFGF光密度相對于β-actin的比值(±s)

表1 兔骨髓間充質干細胞移植后第14天各組VEGF、bFGF光密度相對于β-actin的比值(±s)

注:VEGF:血管內皮細胞生長因子，bFGF:堿性成纖維細胞生長因子，β-actin:β-肌動蛋白;A、C組:分別于建模3、10 d后移植骨髓間充質干細胞;B、D組:分別于建模3、10 d后注射0．9%氯化鈉注射液;與B組比較，a P＜0．05;與D組比較，c P ＜0．05

組別 兔數VEGF bFGF A 組 4 0．701 ±0．082a 0．413 ±0．032 a 4 0．613 ±0．079 0．351 ±0．061 B 組 4 0．543 ±0．069 0．295 ±0．053 C 組 4 1．032 ±0．107c 0．543 ±0．046c D組

BMSCs具有強大的自我復制能力，可分化為神經細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、血細胞等多種細胞，并且能夠分泌多種細胞因子，促進血管新生［24］。鑒于BMSCs的多分化潛能，本研究將經體外培養并鑒定成功的BMSCs移植到下腔靜脈血栓模型中，觀察血栓內新生血管生成情況，探討其可能機制。發現BMSCs移植組(A、C組)新生毛細血管數明顯多于0．9%氯化鈉注射液對照組(B、D組)，移植后28 d效果更明顯;而在移植時間的選擇上，建模后10 d(C組)移植效果比建模后3 d(A組)好，其原因可能是在建模早期局部炎性反應較重，炎性因子較多，引起BMSCs凋亡，使新生血管不如后期明顯。進一步觀察發現BMSCs組血栓內VEGF、bFGF蛋白表達均明顯上調，高于0.9%氯化鈉注射液組。表明BMSCs移植可以改變血栓的微環境，在促進新生血管形成的同時，還可增加VEGF、bFGF的表達。

分析以上結果，筆者推測BMSCs促進血栓再通可能與以下機制有關:①BMSCs分化為血管內皮細胞，促進血管新生。如前所述，BMSCs具有分化成早期中胚層和外胚層各種細胞的潛能［25］。已有研究者在體外成功將BMSCs誘導分化為血管內皮細胞［26］，亦有研究發現BMSCs移植可以治療缺血性心臟病，其機制是缺血心肌組織刺激BMSCs分化為血管內皮細胞，單個或多個內皮細胞形成管樣結構，形成新生血管［24］。②BMSCs分泌多種血管生長因子改善血栓微環境，促進血管新生。已有研究證實，BMSCs可以分泌 VEGF、bFGF、胎盤生長因子(PIGF)、促血管生成素-1(Ang-1)等多種血管生長因子［27］。同時有研究表明，在血管新生的早期，bFGF對微血管新生有促進作用，而VEGF主要在促血管新生后期發揮持續作用［28］。另外，BMSCs還可以通過釋放VEGF、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等引起循環中的干細胞歸巢，促進血管新生和組織修復［27］。本研究發現，BMSCs移植組較0.9%氯化鈉注射液對照組血栓組織中VEGF、bFGF表達明顯增強，說明BMSCs分泌的VEGF、bFGF在促血管新生中起重要作用。③BMSCs促進側支血管的形成。BMSCs可以分化為血管內皮細胞和平滑肌細胞，直接參與側支血管結構的構建，同時還可以通過分泌多種細胞因子、生長因子、化學遞質等促進骨髓源性的EPCs聚集和活化，通過抑制內皮細胞和平滑肌細胞凋亡等方式促進側支血管的形成和塑形［29］。側支血管數量的增加和管徑的增粗對于建立有功能的側支循環網絡、促進血液回流具有重要意義。

目前BMSCs被廣泛應用于各系統疾病的治療，而用于DVT少有報道。本研究在動物模型中發現，BMSCs能夠改變血栓的微環境，促進血栓的機化和再通，為下一步臨床應用BMSCs移植治療人下肢DVT打下了堅實的基礎。

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