維生素C提高小鼠體細胞核移植胚胎的發育潛能

史三寶，紀冬梅，陳蓓麗，郝 燕，陳大蔚，周 平，章志國，曹云霞

維生素C提高小鼠體細胞核移植胚胎的發育潛能

史三寶，紀冬梅，陳蓓麗，郝 燕，陳大蔚，周 平，章志國，曹云霞

探討不同濃度維生素C和培養時間對小鼠體細胞核移植胚胎發育潛能的影響。不同濃度維生素C（0、50、100 mg／L）分別處理小鼠核移植重構胚，50 mg／L維生素C濃度組處理重構胚18 h，獲得的囊胚率以及胚胎著床率顯著高于其他組（P＜0.05），且在此基礎上提高維生素C濃度或處理時間不能進一步提高克隆胚的發育潛能（P＞0.05）。小鼠體細胞核移植胚胎培養時，適當的維生素C濃度和培養時間可顯著提高小鼠重構胚的發育潛能。

維生素C；體細胞；核移植；胚胎；發育潛能

體細胞核移植動物不僅可以用于基礎醫學研究，還可用于再生醫學領域核移植胚胎干細胞替代治療疾病。雖然體細胞核移植哺乳動物早在上個世紀就已被成功報道［1］，而且近年來已開展了很多關于提高小鼠體細胞核移植克隆效率的相關研究［2］，但是仍然沒有太多的進展［3－4］。維生素C是許多動物的一種必需營養物質，同時也是有效的抗氧化劑［5］。最近研究［6］顯示，維生素C可以提高小鼠和人誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）產生效率，促進部分重新編程iPS細胞過渡至完全重編程狀態，并且可能是通過減少細胞內抑癌基因p53的完全表達來提高細胞重編程效率。因此，維生素C促進細胞重編程是安全的。該研究旨在探討維生素C也可能改善小鼠體細胞核移植克隆效率。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級F1（C57BL*CBA）雜交鼠，68周齡，20～26 g，購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 試劑與儀器培養液G-Gamete、G-1plus、G-2plus購自瑞典Vitrolife公司；透明質酸酶、氯化鍶（SrCl2）、礦物油、細胞松弛素B（cytochalasin B，CB）、無鈣CZB液、胎牛血清（BSA）等均購自美國Sigma公司；7%聚乙烯吡咯烷酮（7%PVP）購自美國Sage公司；孕馬血清（PMSG）及人絨毛膜促性腺激素（hCG）購自寧波生物工程有限公司。拉針儀（PN-300型）、磨針儀（EG-40型）、電融合儀（ECM2001，BTX）、玻璃管及機械針（G-100）購自澳大利亞CryoLogic公司；倒置顯微鏡（CE-2000，Nikon）、顯微操作系統（IX-71）購自日本Olympus公司。

1.3 卵子促排6～8周齡的雌性F1（C57BL* CBA）雜交鼠，光照12 h／d，自由攝食飲水。腹腔注射7.5 IU PMSG，46～48 h后腹腔注射7.5 IU hCG，17.5 h時頸椎脫臼處死，取出卵丘卵團復合體，37℃、0.08 IU／L透明質酸酶消化3 min去除顆粒細胞，取表明光滑、胞漿質地均勻的卵子置于G-Gamete液滴中備用。

1.4 顯微操作針

1.4.1 持卵針 將事先制備出的機械針于直徑80 ～90 μm處切割并將末端烤成均勻鈍圓，使其外徑為80～90 μm，內徑為13～15 μm。

1.4.2 去核針 將事先制備出的機械針在? 10 μm處切割并將其相對磨針儀30度角固定，加適量無水乙醇，調整磨針儀轉速，磨針3 min；然后垂直于鍛針儀電熱絲正上方，緩慢加熱電熱絲，勻速調整玻璃針，烤平去核針內管口，使內徑為8～10 μm，外徑為10～12 μm。

1.4.3 注射針 參照去核針，注射針外徑約為7 μm，內徑約為5 μm。

1.5 體細胞核移植方法

1.5.1 去核 本實驗統一采用透明帶打孔法。將事先選好的卵子置于顯微操作液滴A（G-Gamete＋5 μg／ml CB）里，用持卵針及去核針調整卵子的位置，第一極體位于12點時持卵針固定，將原始機械針由卵子1點位置刺入，11點刺出，然后持卵針釋放卵子，并用機械針與持卵針反復摩擦，使卵子從機械針上自動脫落。再次調整卵子使核位于3點鐘位置固定，去核針負壓勻速吸除極體及周圍卵核質［10］，見圖1A。

1.5.2 注核 將去核后的卵子置于G-1液滴中，37℃、5%CO2培養箱內培養1 h，然后移入顯微操作液B（G-Gamete）中注核。同時用注射針于PVP液滴中處理顆粒細胞，將吸有破膜顆粒細胞的注射針由去核路徑注入卵黃膜內，見圖1B。

1.6 重構卵的激活與培養

1.6.1 激活 將注核后的重構卵移入事先制備的10 mmol／L SrCl2＋5 μg／ml CB＋10%BSA的無鈣CZB中激活約5 h，并繼續在含5 mg／L CB的G-1 Plus中培養3 h，當重構卵胞質中出現類原核或分裂為2-細胞且各含1個原核時，確定為激活成功［11］。

1.6.2 培養 將成功激活的一部分重構卵分3組移入0、50、100 mg／L維生素C的培養液分別培養小鼠重構胚18 h，換液培養觀察重構胚的發育情況并記錄。在50 mg／L維生素C基礎上將另一部分重構卵再分3組，一組為無維生素C對照，另兩組統一在50 mg／L維生素C培養液分別培養18 h和36 h后再換液，觀察并記錄囊胚發育情況。

1.7 重構胚移植核移植胚胎發育2.5 d時制備ICR母鼠為假孕受體，3.5 d時將核移植發育得到的囊胚移植至雙側子宮內，移植時小鼠全身麻醉，移植后恢復2～3 h，待小鼠清醒后再進食。

1.8 統計學處理數據采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，各種率的比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 囊胚發育情況不同維生素C濃度和處理時間組均獲得了核移植優質囊胚，見圖1C。

2.2 不同維生素C濃度處理組的胚胎發育50 mg／L維生素C組的小鼠克隆胚的卵裂及囊胚率顯著高于不含維生素C組（P＜0.01），但進一步提高維生素C濃度并沒有進一步提高重構胚的發育率，見表1。

表1 不同維生素C濃度下重構胚的發育情況［n（%）］

2.3 不同維生素C處理時間組的胚胎發育重構胚移入含有濃度為50 mg／L維生素C培養液中分別培養0、18、36 h得出，維生素C中培養18 h組小鼠重構胚的卵裂及囊胚率均顯著高于0 h組（P卵裂＜0.01，P囊胚＜0.05），將維生素C處理時間從18 h延長至36 h并沒有進一步提高胚胎發育率。見表2。

表2 50 mg／L維生素C下不同處理時間重構胚的發育情況［n（%）］

2.4 胚胎移植本研究用ICR假孕母鼠為受體，共移植小鼠核移植重構胚360枚，其中未處理160枚，移植4只受體，維生素C培養18 h組200枚，移植5只受體，平均每只受體移植40枚核移植胚胎，并與移植后第9天處死代孕母鼠，檢查子宮內著床情況，最終維生素C組3只見著床點（60%），見圖1D，未處理組僅1只見著床點（25%）。

圖1 體細胞核移植去核與注核以及重構胚體內外發育情況

3 討論

本研究中，小鼠克隆胚胎在維生素C濃度為50 mg／L的培養液中處理18 h囊胚發育率顯著高于未處理組。可能是由于維生素C改善了克隆胚培養液的培養條件。據研究［5］報道，抗壞血酸在某些培養體系中可以作為有效的抗氧化劑。另一方面，延長維生素C處理時間至36 h并沒有提高囊胚率，這表明維生素C處理18 h可以提高著床前胚胎的發展潛力。重構胚起始的18 h也是被公認的分化細胞細胞核重編程激活的時間窗［7］。同時也顯示出，后期補充維生素C不能進一步提高囊胚形成率，雖然囊胚率也高于未處理組。

哺乳動物克隆重構胚的不完全重編程是主要的技術缺陷［7］。組蛋白乙酰化是核移植中供體細胞和受體胞質中的關鍵表觀遺傳標記，而且組蛋白H4已經被證明直接誘導核染色質更精確的組裝［8］。本研究用50 mg／L維生素C處理小鼠體細胞克隆胚胎18 h，顯著提高了重構胚的發育潛能，可能是維生素C在一定程度上提高了重構胚內相關因子的表達水平。

雖然胚胎在體外發育至囊胚階段能力已被用來作為預測體細胞核移植的效率，但是體外培養階段的胚胎，通常不能預測胚胎的體內妊娠結局［9］。因此，本研究中也做了胚胎移植，得到的結果是維生素C組的著床率（60%）顯著高于正常對照組（25%），進一步證實維生素C還可以提高小鼠體細胞核移植胚胎的著床率。

維生素C可顯著提高小鼠體細胞核移植重構胚的囊胚發育率，促進核移植胚胎在子宮內的著床，具有重要的應用價值。

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［3］Wakayama T.Development of novel intracytoplasmic sperm injection and somatic cell nuclear transfer techniques for animal reproduction［J］.Anim Sci J，2011，82（1）：8－16.

［4］Oda M，Shiota K，Tanaka S.Trophoblast cell lineage in cloned mouse embryos［J］.Dev Growth Differ，2010，52（3）：285－91.

［5］Kere M，Siriboon C，Lo N W，et al.Ascorbic acid improves the developmental competence of porcine oocytes after parthenogenetic activation and somatic cell nuclear transplantation［J］.J Reprod Dev，2013，59（1）：78－84.

［6］Esteban M A，Wang T，Qin B，et al.Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells［J］.Cell Stem Cell，2010，6（1）：71－9.

［7］Han J W，Yoon Y S.Epigenetic landscape of pluripotent stem cells［J］.Antioxid Redox Signal，2012，17（2）：205－23.

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Vitamin C enhanced the potential of mouse somatic cell nuclear transfer embryos

Shi Sanbao，Ji Dongmei，Chen Beili，et al
（Center of Human Reproductive Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

To investigate the impact of different concentrations and time of vitamin C on mouse somatic cell nuclear transfer embryo development potential.Mice reconstructed embryos were treated with different concentrations（0，50，100 mg／L）of vitamin C，the blastocyst and implantation rate was significantly higher than the other groups when this embryos were treated with 50 mg／L concentrations of vitamin C for 18 h（P＜0.05），on the basis of this condition，developmental potential of cloned embryos could not be further enhanced either by increasing the concentration of vitamin C or by prolonging the processing time（P＞0.05）.Appropriate concentrations and incubation time of vitamin C could significantly improve the developmental potential of reconstructed embryos in the process of mouse somatic cell nuclear transfer.

vitamin C；somatic cell；nuclear transfer；embryo；development potential

R 394.2

1000－1492（2014）05－0679－03

2013－12－10接收

安徽醫科大學第一附屬醫院青年培育基金（編號：3101005002061）；國家自然科學基金面上項目（編號：81370691）

安徽醫科大學第一附屬醫院生殖中心，合肥 230022

史三寶，男，碩士研究生；

曹云霞，女，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：caoyunxia6＠126.com；

章志國，男，研究員，責任作者，E-mail：zzg100ster＠gmail.com