tumstatin基因修飾的CD34＋造血干細胞生成抗血管生成活性的血小板

李 娟，羅以勤，丁邦勝，賀學姣，周 明，趙 亮，姚麗娟

tumstatin基因修飾的CD34＋造血干細胞生成抗血管生成活性的血小板

李 娟1，羅以勤1，丁邦勝1，賀學姣1，周 明2，趙 亮1，姚麗娟1

目的以慢病毒為基因載體，將tumstatin cDNA導入CD34＋造血干細胞，在體外誘導生成tumstatin基因修飾的巨核細胞（MKs）和血小板，檢測產生的血小板對血管內皮細胞管狀結構形成的作用。方法構建pLVX-tumstatin-mCMVZsGreen重組載體后轉染293T細胞進行病毒包裝。用密度梯度離心法結合免疫磁珠分離法富集臍血中CD34＋造血干細胞。用慢病毒感染CD34＋造血干細胞，在細胞因子組合培養液中誘導MKs生成，流式細胞儀和形態學檢測MKs的生成及產血小板情況。應用RT-PCR法和Western blot法檢測tumstatin基因的表達，通過人臍靜脈血管內皮細胞管狀結構形成抑制試驗研究血小板內容物生物學活性。結果選擇最佳感染復數（MOI）30∶1感染干細胞時效率最高；流式細胞術檢測結果顯示，細胞在誘導過程中，轉染組與未轉染組細胞都有MKs與血小板的生成，且生長速度和分化趨勢基本相同。在轉染的MKs基因組里，RT-PCR法檢測到738 bp tumstatin基因片段。Western blot法檢測到tumstatin在轉基因細胞來源的血小板中穩定表達，血小板可明顯抑制人臍靜脈內皮細胞管狀結構形成。結論基因修飾的CD34＋造血干細胞在體外成功誘導分化為MKs和血小板并表達tumstatin蛋白，且這種血小板在體外顯著抑制人臍靜脈血管內皮細胞的管狀結構形成。

tumstatin；慢病毒載體；CD34＋造血干細胞；血管內皮細胞；巨核細胞；血小板

血小板中含有許多血管新生促進因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等以及血管生成抑制因子如凝血酶敏感蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）等，這些因子在血管生成中起到重要的調節作用［1］。研究［2］顯示，盡管血管生成抑制因子和促進因子均存在于血小板α顆粒內，但血小板在影響血管生成過程中，總的趨勢是促進血管生成。腫瘤細胞可釋放血小板活化因子誘導循環中的血小板活化和聚集，使其釋放顆粒里的內容物，為腫瘤血管生成提供了豐富的血管生成促進因子，從而影響腫瘤的生長和轉移［3］。研究［4］顯示tumstatin是一種內源性血管生成抑制劑，大量來源于腎、肺、睪丸基底膜上的Ⅳ膠原α3鏈。tumstatin通過功能性受體特異性地誘導血管內皮細胞凋亡、抑制血管內皮細胞增殖，從而抑制腫瘤的生長。

該研究以慢病毒為基因載體，將tumstatin cDNA導入CD34＋造血干細胞，進一步在體外誘導其大量生成tumstatin基因修飾的巨核細胞（megakaryocytes，MKs）和血小板，并檢測產生的血小板對血管內皮細胞管狀結構形成的抑制作用。基因修飾的MKs／血小板過表達血管生成抑制因子tumstatin，有可能改變血管生成過程中血小板促進因子作用持續地占主導的地位。這種過表達目的蛋白的MKs／血小板，或可稱之“治療性”MKs／血小板，對腫瘤治療以及化療引起的血小板減低癥治療可能有著重要的價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑模板質粒tumstatin由安徽醫科大學附屬省立醫院檢驗科實驗室保存；pLVX-mCMV-ZsGreen載體質粒及包裝試劑盒購自深圳百恩維生物科技有限公司；臍血由安徽醫科大學附屬省立醫院產科提供；人重組TPO、IL-3、IL-6、SCF購自英國Pepro Tech公司；無血清培養液Stem SpanTMSFEM購自加拿大Stem Cell Technologies公司；CD34＋、CD61＋細胞分選試劑盒購自德國Miltenyi Biotee GmbH公司；抗人CD34和CD41a單抗均購自美國eBioscience公司；兔抗人tumstatin抗體購自英國Abcam公司；人靜脈內皮細胞購自上海吉凱公司。

1.2 方法

1.2.1 pLVX-tumstatin-mCMV-ZsGreen載體的構建及慢病毒包 以pMAL-tumstatin質粒為模板，用PCR法擴增tumstatin，在引物中分別引入SpeⅠ和BamHⅠ酶切位點，上游引物序列：5′-CTAGACTAGTGCCACCATGCCAGGTTTGAAAGGAAACGTGG AG-3′，下游引物序列：5′-CGCGGATCCTCAGTGTCT TTTCTTCATGCACACCTG-3′，劃線部分為酶切位點。慢病毒載體pLVX-mCMV-ZsGreen及PCR擴增產物tumstatin經BamHⅠ和SpeⅠ雙酶切，純化后的產物在T4DNA連接酶作用下進行連接。然后將重組質粒轉化感受態細菌進行擴增并抽提質粒，同時做酶切鑒定并測序。重組表達質粒pLVX-tumstatinmCMV-ZsGreen和空慢病毒載體與包裝質粒共轉染293T細胞進行重組慢病毒顆粒包裝，按試劑盒說明書進行，收集上清液過濾后－80℃保存。HEK 293細胞進行滴度測定，用熒光顯微鏡計數熒光細胞數量，在最高稀梯度10m的孔數出現N（N＜10）個帶熒光的細胞，則病毒滴度為N×10mTU／μl。

1.2.2 CD34＋細胞的篩選及慢病毒感染復數（multiplicity of infection，MOI）初篩 經產道分娩胎兒后，收集臍血于CPDA無菌采血袋內，4℃保存。采用密度梯度離心法將臍血按4∶1比例加入羥乙基淀粉沉淀紅細胞，收集上層血漿，緩慢加至Ficoll-Hypaque分離液上，離心收集白膜層，PBS洗滌2次得到人臍帶血的單個核細胞，按照CD34＋細胞免疫磁珠分選試劑盒說明書進行分選后，將CD34＋細胞接種于含50 μg／L細胞因子TPO、IL-3、IL-6、SCF的完全培養基中預培養，并留取30 μl細胞液流式測定CD34＋細胞純度。將預培養72 h后的5×104個細胞轉入12孔板，將制備保存的慢病毒按感染復數（MOI）0、1∶1、10∶1、30∶1、50∶1感染細胞，在8 μg／ml的Polybrene存在下，于30℃、800 r／min離心1 h后，種回至12孔板中，每孔加細胞因子組合培養液1 ml繼續培養過夜。12 h后換液，此后每2～3 d換液1次并用倒置熒光顯微鏡下觀察細胞感染情況觀察熒光表達情況，培養1～2周后計算轉染效率。以表達ZsGreen綠色熒光的細胞為轉染陽性細胞，統計同一視野下轉染陽性細胞數和總細胞數。根據以下公式計算轉染效率：轉染效率＝ZsGreen陽性細胞數／總細胞數×100%。轉染效率90%以上的最低MOI值為最適MOI。

1.2.3 誘導MKs和血小板的生成及流式細胞術分析和細胞形態學分析 將細胞分為3組：無病毒感染組、不含目的基因空病毒感染組和含目的基因病毒感染組，將病毒液按照MOI初篩實驗的最佳MOI值感染CD34＋細胞。觀察細胞感染情況后，在上述細胞因子組合培養液中繼續培養、誘導分化，適當傳代換液。在第3、7、14天時，取相應細胞，PBS離心洗滌后分別加入抗CD34、抗CD41a的單抗及同型對照抗體，避光孵育45 min，PBS離心并重懸到1%多聚甲醛溶液中，進行流式分析鑒定MKs。同時，收集培養細胞上清，先低速離心去除細胞和碎片，再高速離心得血小板沉淀后，分別加入同型對照抗體和抗CD41a的抗體，避光孵育45 min，PBS離心后重懸到1%多聚甲醛溶液中，進行流式分析血小板。另取細胞進行瑞氏染色進行形態學分析。

1.2.4 MKs和血小板tumstatin的檢測 用CD61＋磁珠分離收集上述3組細胞來源的MKs，用TRIzol裂解細胞提取總RNA，經逆轉錄后用特異性tumstatin引物（同上）進行PCR檢測，25 μl總反應體系，按95℃2 min，95℃30 s變性，58℃30 s退火，72 ℃1 min延伸，共30個循環，最后72℃反應1 min 后4℃停止。將各組PCR產物行凝膠電泳分析產物。同時收集3組細胞來源的血小板提取總蛋白，用Brandford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，然后按正極濾紙-PVDF膜-PAGE凝膠-濾紙負極的順序進行轉膜，結束后加入5%的脫脂奶粉封閉。最后將膜置于tumstatin一抗中4℃過夜，再置于辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗液中，搖床上孵育1 h。參考Thermo ECL產品說明書，在化學發光成像系統顯色拍照分析。

1.2.5 轉基因血小板內皮細胞管狀結構形成抑制實驗 分別收集2組細胞來源的血小板1×108／ml，以新分離的正常人血小板為對照，利用液氮反復凍融3次裂解血小板，釋放蛋白。50 μl稀釋的ECMa-trixTM（CHEMICON）加入96孔培養板，37℃孵育1 h待ECMatrixTM凝固，將150 μl不含抗生素的HUVECs（臍靜脈內皮細胞）接種到上述包被ECMatrixTM的培養板中，每孔含細胞數量為5×103～1× 104個，然后加入血小板裂解液。試驗重復3次。細胞在37℃、5%CO2條件下繼續培養，在1、2、4、8、12 h時間點觀察不同處理組之間內皮細胞管狀排列情況、單位面積內管狀結構數量和完整程度的差異。

1.3 統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結果

2.1 重組質粒酶切鑒定及慢病毒包裝本研究用慢病毒質粒含雙啟動子，分別促進目的蛋白tumstatin和標記蛋白ZsGreen表達（圖1A）。將構建抽提好的重組質粒用SpeⅠ＋BamHⅠ進行雙酶切，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳發現738 bp的目的條帶和載體質粒條帶，說明慢病毒載體上連入了tumstatin基因（圖1B）。將重組質粒pLVX-tumstatin-mCMVZsGreen與包裝質粒共轉染293 T細胞，進行慢病毒的包裝。轉染293 T細胞48 h后，熒光顯微鏡觀察細胞被感染情況（圖1C）。包裝后得到的慢病毒tumstatin液進行10倍梯度稀釋后感染HEK 293細胞，在107稀釋梯度孔發現超過10個含熒光細胞，而108稀釋梯度孔發現1個含熒光細胞，因此慢病毒tumstatin滴度為1.0×108TU／ml。

2.2 CD34＋細胞純度鑒定及感染MOI值初篩每袋臍血體積為100～120 ml，含單個核細胞（0.5～1）×108個。臺盼藍染色顯示細胞活力良好，死細胞較少。CD34＋免疫磁珠分選得（0.5～1.5）×106個CD34＋干細胞，流式細胞術測得CD34＋干細胞的純度達到約98.5%。通過MOI初篩實驗發現MOI 30∶1轉染CD34＋干細胞感染率較高且熒光持續較長，而50∶1的MOI值轉染的細胞雖然熒光出現較早但細胞死亡較多，MOI 10∶1比1∶1的CD34＋干細胞感染率高但是較MOI 30∶1仍然較低。因此，慢病毒感染CD34＋干細胞時，選擇MOI 30∶1為最佳值進行感染實驗，見圖2。以表達綠色熒光的細胞為轉染陽性細胞，熒光顯微鏡分析、計算細胞轉染率為90.3%。

圖1 重組慢病毒鑒定圖

圖2 綠色熒光蛋白ZsGreen在轉染細胞的表達

圖3 CD34＋誘導分化MKs及血小板

2.3 誘導分化的MKs及血小板檢測流式細胞術鑒定結果：由于CD34主要是干細胞的標志，CD41a是MKs和血小板的特異性抗體，因此可檢測CD34和CD41a分子在第3（轉染前）、7、14天的表達來觀察MKs的分化情況以及MKs產血小板情況。結果顯示：無病毒感染組、不含目的基因空病毒感染組及含目的基因病毒感染組細胞在相同的時間，其細胞表面CD34和CD41a分子表達變化趨勢基本相同，說明空病毒感染及含目的基因的病毒感染基本不影響細胞培養過程中的分化。同時，對不同天數細胞CD34和CD41a分子表達比較，最初分選得CD34＋細胞陽性率約為98.5%，經3 d培養之后CD34＋細胞陽性率變化不大，其中37.7%的細胞同時表達CD41a分子；隨著時間的增加，表達CD34分子細胞越來越少，第14天時，CD34＋細胞不到2%；而CD41a細胞卻不斷增加，但第14天之后，增加速度緩慢。在進行血小板流式分析時，對培養細胞上清中的沉淀加CD41a分子標記（圖3A、B、C），同時用全血中分離的血小板設門，結果顯示：細胞培養第7天已有少量血小板分泌，在14 d和21 d時，血小板有明顯增多（圖3D、E）。瑞氏染色進行形態學分析表明經過14 d的培養后轉基因細胞呈現出典型的MKs形態，核多葉，并產有大量的血小板（圖3F、G）。研究結果表明轉基因表達并不影響CD34＋細胞誘導分化為巨MKs和血小板。

2.4 MKs tumstatin基因表達、血小板tumstatin蛋白表達檢測CD61＋磁珠分離培養14 d MKs，RTPCR法檢測結果表明含目的基因慢病毒感染組有738 bp的特異性擴增條帶，而無病毒感染組和不含目的基因空病毒感染組無特異性擴增條帶（圖4A）。說明tumstatin基因成功導入CD34＋干細胞基因組中并隨著細胞分化為MKs，tumstatin基因也存在于MKs中。Western blot法檢測結果表明，3組細胞中來源于無病毒感染組和不含目的基因空病毒感染組血小板裂解物無tumstatin蛋白條帶，含目的基因病毒感染組血小板有tumstatin蛋白條帶（圖4B）。表明通過慢病毒介導，tumstatin基因轉入CD34＋細胞，經誘導分化在MKs和血小板中得到表達。

圖4 MKs tumstatin基因表達、血小板tumstatin蛋白表達

2.5 基因修飾血小板血管內皮細胞管狀結構形成抑制實驗基因修飾的血小板具有抗新生血管生成的作用，進行了內皮細胞管狀結構形成抑制試驗。當HUVECs在基質上培養時，它們迅速排列形成中空管狀結構，與正常分離血小板和未轉染血小板比較，tumstatin基因修飾的顯著抑制內皮細胞管狀結構形成。研究結果顯示未修飾的血小板血管分支數（NBP）＝82.12±13.1；tumstatin基因修飾血小板NBP＝38.2±7.8；而正常人分離血小板NBP＝146.7±17.8，3組間比較差異有統計學意義（F＝114.51，P＜0.05）。表明tumstatin基因修飾血小板與正常血小板和未轉染血小板不同，能顯著抑制內皮細胞管狀結構的形成，進而推測在體內有可能抑制腫瘤新生血管形成。見圖5。

A：未修飾的血小板內皮細胞管狀結構形成 ×10；B：tumstatin基因修飾血小板管狀結構形成 ×10；C：正常血小板內皮管狀結構形成 ×10；D：各分枝數比較；與未修飾的血小板比較：*P＜0.05；與正常人血小板比較：＃P＜0.05

3 討論

血小板被認為在止、凝血過程中發揮主要作用，但近些年研究［5］顯示血小板能夠促進腫瘤生長和轉移，血小板數量增多與腫瘤生長和轉移具有正相關性，而降低血小板數量或者抑制其功能可以明顯抑制腫瘤生長和轉移［6］。生理狀態下腫瘤微環境中血小板釋放血管生成調節因子參與調節血管生成，但其血管生成促進因子的作用持續地占有主導地位［1，7］。本研究通過慢病毒介導基因修飾血小板前體細胞，經過誘導、分化后在MKs和血小板中成功過表達血管生成物抑制因子tumstatin，與正常人血小板比較，這種血小板內容物在體外顯著抑制人臍靜脈血管內皮細胞的管狀結構形成。

tumstatin通過特異性抑制內皮細胞蛋白的合成來實現對腫瘤新生血管的抑制作用。tumstatin與αvβ3整合素相互作用，抑制局部粘著斑激酶（FAK）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B （PKB／Akt）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，從而降低了真核起始因子4E的磷酸化，在翻譯的過程中，真核起始因子4E無法與4E結合蛋白1分離，導致帽子依賴型蛋白的合成受到抑制。tumstatin抗血管活性至少是血管抑素endostatin的10倍［8］。因此，考慮用tumstatin作為基因修飾血小板的抗血管生成因子。

該研究慢病毒啟動子為CMV啟動子，可啟動基因在多種細胞表達，無選擇性，轉染的CD34＋細胞可向不同細胞系分化。因此，tumstatin除了在MKs和血小板中表達外，還會在紅細胞系和粒細胞系表達。為了讓基因只在MKs和血小板中表達，可選擇MKs／血小板特異性啟動子如GpIba［9］。另外，可通過優化培養液的細胞因子組合，引導基因轉染細胞主要分化為MKs和血小板。MKs定義為CD41a＋、CD61＋細胞，因此可用CD61磁珠分離獲得向MKs／血小板分化的較為單一的細胞。這種方法可除去其他細胞及碎片，有利于MKs和血小板的產生。

隨著CD34＋在體外增殖分化為MKs和血小板技術日趨成熟，為基因修飾血小板研究血小板相關蛋白功能和治療遺傳性血液病如血友病、巨血小板綜合征提供了可能［8］。血小板可與腫瘤細胞形成聚集，黏附于血管內皮，腫瘤細胞可激活血小板釋放血小板內容物［10］，因此，通過慢病毒介導在血小板中過表達血管生成抑制因子tumstatin，產生“治療性”血小板，在腫瘤治療中可能具有一定潛力。如腫瘤化療時可輸注“治療性”血小板，有可能解決化療藥物引起的血小板減少癥、輸注常規血小板引起的促進腫瘤新血管生長的問題；并有可能使抗血管生成基因治療聯合化療發揮更大的抗腫瘤效果，這些推測有待于進一步研究證實。

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Tumstatin gene-modified CD34＋hematopoietic stem cells produce anti-angiogenic platelets

Li Juan，Luo Yiqin，Ding Bangsheng，et al
（Dept of Clinical Laboratory，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveCD34＋hematopoietic stem cells transfected with recombinant lentivirus vector carrying tumstatin cDNA were in vitro induced to produce megakaryocytes（MKs）and platelets.The inhibitory effect of the platelets on the growth of capillary tube structures of HUVEC were detected.MethodsConstructed pLVX-tumstatin-mCMV-ZsGreen recombinant vector was transfected into 293T cells for virus packaging.Cord blood CD34＋hematopoietic stem cells enriched by immunomagnetic separation were transfected with recombinant lentivirus and induced to produce megakaryocytes in the culture medium combinations of cytokines.Flow cytometry and morphological observation were used to detect the generation of megakaryocytes and platelets.RT-PCR and Western blot analysis were applied to examine the expression of tumstatin.Capillary tube structures assay of HUVEC was used to evaluate the inhibitory effect of the platelets in vitro.ResultsCD34＋hematopoietic stem cells transfected with recombinant lentivirus at the best multiplicity of infection（MOI）being 30∶1，ZsGreen positive rate of which was highest.The transfected and untransfected cells generated megakaryocyte and platelets，the growth rate and differentiation trend of which were substantially identical by flow cytometry analysis.RT-PCR detected a 738 bp tumstatin cDNA in transfected MKs.Western blot confirmed the expression of tumstatin protein in gene-modified megakaryocyte and platelets.Tumstatin gene-modified platelets inhibited the capillary tube structures of HUVEC.ConclusionGene-modified CD34＋hematopoietic stem cells not only successfully differentiate into megakaryocyte and platelets but also express tumstatin protein，and this transgenic platelets significantly inhibit the capillary tube structures of HUVEC in vitro.

tumstatin；lentivirus vector；CD34＋hematopoietic stem cell；HUVEC；megakaryocyte；platelet

R 349.63；R 331.2

1000－1492（2014）05－0576－06

2013－12－10接收

安徽省自然科學基金（編號：11040606M208）；安徽省高等學校省級自然科學研究項目（編號：KJ2011A163）

安徽醫科大學附屬省立醫院1檢驗科、2輸血科，合肥230001

李 娟，女，碩士研究生；

羅以勤，男，副教授，主任技師，碩士生導師，責任作者，E-mail：luoyiqin2003＠163.com