利用晚疫病菌無毒基因瞬時表達技術鑒定馬鈴薯抗病基因

周晶，張子瑩，路遠，田振東，謝從華

（園藝植物生物學教育部重點實驗室，國家蔬菜改良中心華中分中心，華中農業大學，湖北武漢430070)

病蟲防治

利用晚疫病菌無毒基因瞬時表達技術鑒定馬鈴薯抗病基因

周晶，張子瑩，路遠，田振東*，謝從華

（園藝植物生物學教育部重點實驗室，國家蔬菜改良中心華中分中心，華中農業大學，湖北武漢430070)

由Phytophthora infestans引起的晚疫病是馬鈴薯的毀滅性病害。明確現有馬鈴薯品種或育種材料含有的晚疫病抗病基因，對于抗病育種和合理利用不同抗病基因防治馬鈴薯晚疫病具有重要意義。根據“基因對基因”學說，馬鈴薯無毒基因與抗病基因產物互作會產生典型過敏反應（HR）。理論上利用病原菌無毒基因可以鑒定馬鈴薯是否含有相應抗病基因。本研究嘗試利用農桿菌注射技術，在馬鈴薯葉片中瞬時表達晚疫病菌無毒基因（Avr），根據過敏反應發生情況，進而推斷馬鈴薯品種/育種材料所含相應抗病基因（R）。研究結果顯示：適合馬鈴薯瞬時表達的農桿菌濃度為0.5（OD600），馬鈴薯材料農桿菌瞬時表達存在明顯的基因型和葉齡依賴性，充分展開的幼嫩葉片適合農桿菌瞬時表達。Avr1,Avr2,Avr3a和Avr4在含有相應抗病基因的馬鈴薯鑒別寄主上瞬時表達能夠產生HR，表明無毒基因注射鑒定結果是可靠的。無毒基因注射鑒定結果與抗病基因特異引物PCR擴增結果在不同基因型材料上有時并不一致，反映了這兩種方法各有局限性，若能將這兩種方法結合使用，則會提高鑒定結果的準確性。

馬鈴薯；晚疫病；無毒基因；抗病基因；瞬時表達；農桿菌注射

馬鈴薯是世界第四大糧食作物，僅次于水稻、玉米和小麥[1]。馬鈴薯在生產過程中受到多種病原菌的危害，其中由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是最嚴重的病害之一。選育抗晚疫病品種是防治晚疫病最經濟、最環保的方法。當前馬鈴薯抗晚疫病育種利用的抗病基因主要是來自野生種Solanum demissum的R1-R11 11個主效R基因[2]。這11個主效R基因已被定位，其中R1、R3a和R3b基因已被克隆[3-5]；R1、R2、R3、R4和R10基因已經被廣泛的用于馬鈴薯育種[6]。另外來自于不同馬鈴薯野生種的10多個不同R基因也已被克隆[6,7]，這些抗病基因的克隆為馬鈴薯抗晚疫病育種提供了重要基因資源。由于晚疫病病菌變異迅速，導致馬鈴薯抗病基因很快失去抗性[8]。因此，在不同產區根據晚疫病生理小種組成來選擇合適的抗病品種就顯得尤為重要。目前國內研究者已開展了馬鈴薯產區晚疫病菌生理小種變化的動態監測，基本明確了病原菌群體結構，為晚疫病防治奠定了基礎[9-11]。中國已育成馬鈴薯品種近300個，但是這些品種含有那些抗病基因并不清楚，這對合理布局含有不同抗性基因的品種防治晚疫病造成很大困難。

根據“基因對基因”假說[12]，抗病基因產物和病原菌無毒基因（Avr）產物識別可以產生過敏反應（Hypersensitive response,HR），因此，理論上可以利用病原菌無毒基因鑒別寄主所含相應抗病基因。目前已在晚疫病菌中鑒定了數個無毒基因（Avr1-R1、Avr2-R2、Avr3a-R3a、Avr3b-R3b和Avr4-R4等），這些無毒基因產物與其對應抗病基因產物識別可以產生典型HR反應[13]。本氏煙草農桿菌注射瞬時表達技術（Agro-infiltration）已成功用于馬鈴薯抗性（R）基因與病原物無毒（Avr）基因間的相互作用研究[14]。但在馬鈴薯上進行農桿菌注射瞬時表達還存在一定困難，主要表現在基因型依賴性，有些材料不適合注射，有些材料注射后沒有反應。作為一種探索性工作，本研究利用Agro-infiltration技術將幾個已知晚疫病菌無毒基因在不同馬鈴薯材料葉片中進行瞬時表達，根據HR反應發生情況，期望快速、準確鑒定馬鈴薯栽培品種及育種材料所含抗病基因，為利用抗病品種合理布局防治晚疫病和抗病育種奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯材料

馬鈴薯鑒別寄主材料LBR-R1,2,3,4和10種薯由華中農業大學實驗室保存，經過催芽在塑料大棚內種植。栽培品種‘華恩1號’、‘青薯168’、‘會-2’、‘鄭薯5號’和‘鄂馬鈴薯3號’及育種材料‘93008’、‘93011’和‘93014’葉片采自馬鈴薯實驗室溫室種植材料。

1.2 無毒基因瞬時表達載體

含有Avr1，Avr2，Avr3a，Avr4和Avr10晚疫病菌無毒基因的雙元表達載體由華中農業大學馬鈴薯實驗室提供，無毒基因插入雙元表達載體pCB-302-3中。含有p19質粒的表達載體用于防止外源基因沉默。pCB-302-3空載體為陰性對照，含有Avr3a/R3a或Vnt1/AvrVnt1基因對的載體為陽性對照。所有質粒都轉化到農桿菌菌株GV3101中。

1.3 農桿菌活化、擴大培養和注射用農桿菌菌液準備

（1）活化：將含有相應無毒基因載體的保存菌液在含有Rif和Kan（50 mg/L）LB固體培養基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L）平板上劃線活化，36～48 h后挑選單菌落，在含有相應抗生素的1 mL LB液體培基中于28℃，250 r/min培養24 h。

（2）擴大培養：取10 μL上述培養菌液，加入含有相應抗生素的5 mL YEB液體培基（胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物1 g/L，牛肉浸膏5 g/L，MgSO4·7H2O，0.5 g/L）的離心管中，于28℃，250 r/min條件下培養24 h。

（3）注射菌液準備：將擴大培養的菌液4 000 r/min離心10 min收集菌體，后加入等體積MMA（10 mmol/L MES(2-N-嗎啡啉乙磺酸)，10 mmol/L MgCl2，200 mmol/L AS（乙酰丁香酮），pH 5.7）懸浮液，懸浮后離心，4 000 r/min離心10 min；倒掉多余MMA，加入1/2體積的MMA，再次懸浮；檢測600 nm下的OD值，用MMA稀釋到試驗所需OD600值；加入含p19載體的農桿菌，室溫靜置2 h左右用于注射。

1.4 馬鈴薯葉片注射

選擇較幼嫩（出苗后40 d）健康的馬鈴薯復葉，事先在葉片上標注注射位點，用2 mL的一次性注射器吸取菌液，在劃定位置上按壓注射，注意不要損傷葉片，以免影響HR反應的辨別；每個處理至少做3次重復，復葉葉柄插入裝有無菌水的三角瓶中，然后將三角瓶放入大塑料框中，用塑料膜覆蓋置于（22±2）℃的房間，12 h光照。每天葉面噴水霧一次，3 d后觀察葉片HR發生情況，記錄并拍照。

1.5 馬鈴薯基因組DNA提取與PCR擴增

馬鈴薯材料基因組DNA小量抽提采用CTAB法。

用于R基因PCR特異擴增的引物根據已有報道設計，具體見表1。PCR體系（20 μL）：ddH2O 15.9 μL，dNTP(10 μmol/L)0.3 μL，10×Buffer 2 μL，Primer F (10 μmol/L)0.3 μL，Primer R(10 μmol/L)0.3 μL，Taq酶0.2 μL，DNA模板1 μL。擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸1～2 min，35個循環后72℃延伸10 min。退火溫度和延伸時間根據具體引物確定。

表1 R基因特異引物序列Table 1R gene specific PCR primers

2 結果與分析

2.1 瞬時表達體系的優化

農桿菌濃度是影響瞬時表達效果的關鍵因素。本試驗首先在馬鈴薯鑒別寄主‘LBR-R3’葉片上分別注射不同OD600值（0.5，1.0和1.5）的含有Avr3a載體、陰性和陽性對照載體的農桿菌（添加含有p19載體農桿菌），觀察注射后馬鈴薯葉片的HR反應。結果顯示在注射8 d后，3個濃度陽性對照和Avr3a注射點都出現明顯HR反應，但是當OD600值為1.5時，個別陰性對照也會出現比較弱的HR反應，而OD600值為0.5，1.0時陰性對照病均未出現HR反應。表明OD600值為0.5菌液濃度適合在馬鈴薯上瞬時表達，濃度高時可能引起假象。圖1顯示鑒別寄主‘LBR-R3’葉片用OD6000.5農桿菌液注射不同天數后HR反應發生情況。

2.2 5個病原菌Avr基因在含有相應R基因鑒別寄主上的表型

為了鑒別Avr1，Avr2，Avr3a，Avr4和Avr10 5個病原無毒基因在含有相應抗病基因的鑒別寄主上能否誘發HR反應，本研究分別在5個鑒別寄主上用OD6000.5的農桿菌液進行葉片注射。結果顯示注射后3～7 d,Avr1，Avr2，Avr3a和Avr4在相應鑒別寄主上能夠誘發HR反應，但Avr10沒有誘發HR反應（圖2）。

圖1 OD6000.5農桿菌菌液(含有Avr3a)注射鑒別寄主‘LBR-R3’葉片不同天數后HR表型Figure 1HR development on potato‘LBR-R3’leaves after agro-infiltrating with 0.5 OD600Agrobacterium suspensions(containing Avr3a)

圖2 無毒基因Avr1、Avr2、Avr3a、Avr4和Avr10在相應鑒別寄主上誘發的HR反應Figure 2HR trigged by transient expressing Avr1,Avr2,Avr3a,Avr4 and Avr10 on R gene diagnose potato materials

表2 馬鈴薯鑒別寄主上的HR發生頻率Table 2HR frequency appeared on corresponding‘LBR-R’plant leaves

進一步統計了無毒基因在相應鑒別寄主上HR的發生頻率（表2），結果顯示陽性對照在所有馬鈴薯材料上均出現HR，陰性對照均未出現HR。從表2可以看出，Avr1,Avr2,Avr3a和Avr4均在對應的‘LBR-R’上產生HR；Avr10未出現HR。Avr2，Avr3a重復性最好，為100%，Avr1次之，Avr4重復性最差。結果表明在有足量重復的前提下，利用這些病原無毒基因、采用農桿菌注射法檢測寄主含有相應抗性基因是可靠的。

2.3 馬鈴薯栽培品種及育種材料葉片無毒基因農桿菌注射結果

為了檢測這5個晚疫病菌無毒基因能否在栽培品種和育種材料上激發HR反應，從而判斷這些品種可能含有的抗病基因，選取栽培品種‘華恩1號’、‘早大白’、‘會-2’、‘中薯3號’和‘鄂馬鈴薯3號’、‘鄭薯5號’及育種材料‘93008’、‘93011’和‘93014’葉片進行了3次重復農桿菌注射試驗。結果表現出三種類型（圖3）：A.陽性對照出現HR,空白未出現HR，表明這些馬鈴薯材料（‘鄂馬鈴薯3號’，‘93008’、‘93011’和‘93014’）適合農桿菌注射（圖3A）。B.所有葉片注射點均產生明顯的壞死斑，表明這些材料（‘華恩1號’、‘早大白’和‘會-2’）對農桿菌侵染表現很敏感（圖3B），不適合采用農桿菌瞬時表達技術來鑒定其所含晚疫病抗性基因。C.注射點均未產生明顯的HR(圖3C)，表明此類馬鈴薯材料（‘中薯3號’、‘鄭薯5號’）對農桿菌侵染表現很不敏感，這類材料也不適合采用農桿菌瞬時表達技術來鑒定其所含晚疫病抗性基因。

‘鄂馬鈴薯3號’經相應無毒基因鑒定可能含有抗病基因R1、R2、R3、R4和R10，育種材料‘93008’可能含有抗病基因R2、R3和R4，育種材料‘93011’和‘93014’可能含有抗病基因R2和R3（圖3A）。

圖3 不同馬鈴薯品種(材料)葉片注射無毒基因后的表型Figure 3Phenotype on different potato leaves after infiltration with different Avr genes

2.4 R基因特異性引物PCR檢測

為了檢驗無毒基因農桿菌瞬時表達鑒定結果是否與分子檢測一致，本研究根據文獻報道的5對晚疫病抗病基因特異引物序列合成PCR擴增引物（表1）。以抽提的馬鈴薯基因組DNA為模板進行PCR擴增。結果顯示R2、R2 family和R4 3對基因特異引物無PCR擴增產物。R1、Rpi-abpt和R3a基因特異引物可以擴增出預期大小的帶型。馬鈴薯材料‘93011’、‘93014’和品種‘早大白’能夠擴增出R1片段（1 400 bp）的條帶（圖4A），‘鄂馬鈴薯3號’和‘93011’能夠擴增出Rpi-abpt（686 bp）片段（圖4B）；馬鈴薯材料‘93011’和品種‘早大白’能夠擴增出R3a片段（980 bp）（圖4C）。盡管本研究使用文獻報道的R基因特異引物進行擴增，并且擴增出與目標片段大小一致的產物，但由于沒有對產物進行測序，因此，不能準確判斷擴增出的片段就是對應R基因的片段，也有可能是其等位基因產物。

圖4 R1、R2、R3a和R4基因在馬鈴薯材料中的PCR鑒定Figure 4PCR amplification in different potato materials using R gene specific primers

表3 農桿菌注射結果與基因特異引物PCR結果比較Table 3Comparison of agro-infiltration andRgene specific primers PCR amplification results

2.5 兩種方法的一致性比較

為了比較農桿菌注射與R基因特異引物PCR結果之間的異同，將兩種方法的結果進行了歸類（表3）。由表3可看出，對于鑒別寄主‘LBR-R1’和‘LBR-R3’，病原無毒基因Avr1和Avr3a農桿菌注射結果與PCR結果一致。Avr2和Avr4盡管農桿菌注射結果為陽性，但PCR沒有擴增出目標帶。對于馬鈴薯品種和育種材料，Avr2和Avr3a農桿菌注射在4個材料（‘鄂馬鈴薯3號’、‘93008’、‘93011’和‘93014’）中出現陽性的頻率較高，但是無相應PCR擴增產物。材料‘93011’、‘93014’和‘早大白’PCR擴增出R1目標帶，但是Avr1注射為陰性。由此可見，兩種方法鑒定結果存在不一致性。

3 討論

明確現有馬鈴薯品種含有的晚疫病抗病基因，對于合理利用品種抗性防治馬鈴薯晚疫病具有重要意義。馬鈴薯晚疫病抗性基因的鑒定一般采用接種含有已知無毒基因的晚疫病菌小種，通過抗性反應來推斷其是否含有相應抗性基因，這種方法費工費時。目前，中國絕大多數栽培品種所含晚疫病抗病基因種類不清楚，本研究利用晚疫病菌無毒基因農桿菌瞬時表達技術探索鑒別馬鈴薯品種含有的抗病基因的方法，以期為利用該方法鑒定馬鈴薯栽培品種及育種資源晚疫病抗性基因奠定基礎。

從研究結果（表2）來看，Avr1、Avr2、Avr3a和Avr4均能夠在對應的鑒別寄主上產生HR，表明這4個無毒基因注射結果是可靠的。但是，不同無毒基因注射點出現HR的頻率有一定差異。如果注射點有足夠數量，利用該方法鑒定馬鈴薯材料所含抗病基因還是可靠的。農桿菌瞬時表達時菌液濃度是一個重要參數，從本研究結果來看，0.5 OD600是比較理想的濃度。農桿菌本身作為一種植物病原菌，很容易引起馬鈴薯系統抗性，因此，濃度太高時可能導致注射點出現壞死斑，造成假象。由于不同馬鈴薯材料的葉片厚薄和致密程度差別很大，有些馬鈴薯材料很難注射；本研究結果顯示葉片生理狀態也是一個顯著影響農桿菌注射效果的關鍵因素，不同葉齡的葉片敏感性不同，充分展開的幼嫩葉片容易注射，HR出現的時間也比較快，老葉很不敏感，不適宜農桿菌瞬時表達。另外發現有些馬鈴薯材料即使幼葉也不能產生HR反應。可見農桿菌瞬時表達在馬鈴薯材料上存在明顯的基因型和葉齡依賴性。

理論上馬鈴薯現有品種抗性基因的鑒定也可利用已知抗病基因特異引物和分子標記進行PCR鑒定，但是到目前為止，能夠用于進行抗病基因分子診斷的實用基因特異引物和分子標記并不多[17]。本研究利用文獻報道的基因特異引物進行了PCR擴增，結果顯示在鑒別寄主上只有Avr1和Avr3a農桿菌注射結果與PCR結果一致。其余無毒基因農桿菌注射結果與PCR結果并不一致，有的無毒基因農桿菌注射結果為陽性，PCR結果為陰性，有的無毒基因農桿菌注射結果為陰性，PCR結果為陽性。反映了這兩種方法的局限性和復雜性。PCR結果也有不確定的因素，一則抗病基因往往與無功能的假基因或同源體成族出現，即便是基因特異引物也有可能出現假陽性擴增，例如有可能擴增出R基因的等位基因；二則即便是同一抗病基因，在不同馬鈴薯材料中可能存在堿基序列變化，如果堿基序列變異位置位于引物結合區域，也可能導致不能擴增。另外，馬鈴薯材料中也有可能存在多個識別同一無毒基因產物的蛋白。綜上所述，無毒基因農桿菌注射和基因特異引物PCR擴增鑒定馬鈴薯材料所含抗病基因都存在不足之處。若將Avr基因農桿菌瞬時表達和抗病基因特異引物PCR擴增結合起來，則會提高鑒定的準確性。如果兩種方法一致，鑒定的準確性會更可靠；即使不一致，至少兩種方法能夠提供互補的有價值信息，可以幫助我們判斷馬鈴薯材料可能含有那些抗病基因。

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《中國馬鈴薯》雜志約稿函

《中國馬鈴薯》雜志是目前全國唯一的馬鈴薯專業科技期刊，國際刊號：ISSN 1672－3635，國內刊號：CN 23－1477/S，郵發代號：14－167，國內外公開發行。它以繁榮我國馬鈴薯產業為辦刊宗旨，積極報道國內外有關馬鈴薯的學術研究、科研動態和各種實用技術的最新消息。該刊由東北農業大學和中國作物學會主管，由東北農業大學和中國作物學會馬鈴薯專業委員會主辦。《中國馬鈴薯》（原名《馬鈴薯雜志》）創刊于1987年。2000年經申請報國家新聞出版總署審批，更名為《中國馬鈴薯》，同年改為大16開本，并增加彩色廣告。2001年《中國馬鈴薯》經報黑龍江省科委及省新聞出版局批準，將原來的季刊改為雙月刊。

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《中國馬鈴薯》雜志編輯部

2014年8月25日

Identification of Late Blight Resistance R Genes of Potato by Transient Expressing of Phytophthora infestans Avirulence Genes
Using Agro-infiltration

ZHOU Jing,ZHANG Ziying,LU Yuan,TIAN Zhendong＊,XIE Conghua
(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology(HAU),Ministry of Education;National Center for Vegetable Improvement(Central China);
Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070,China)

Late blight,caused by Phytophthora infestans,is a devastating disease of potato.It is important to distinguish what kind of R contained in potato cultivar or potato breeding materials for potato late blight resistant breeding and control late blight through management of different R genes.According to the‘gene-for-gene’hypothesis,the interaction between pathogenavirulencegenes（Avr）andresistantgenes（R）willleadtohypersensitiveresponse（HR）inpotato.So,itispossible to distinguish host R gene by Avr gene expression in potato leaves.In this study,efforts were made to distinguish potato R genes by transient expressing P.infestansAvr gene in potato leaves using agro-infiltration methods.The result revealed that 0.5 optical density at 600(OD600)was suitable for potato agro-infiltration.Agro-infiltration mediatedAvr expression efficiency depended on potato genotype and leaf age.Full expanded younger leaves were fit forAgro-infiltration mediated transientAvr gene expression.Transient expressing Avr1,Avr2,Avr3a and Avr4 in leaves of diagnose potato material which containscorresponding R genes led to HR.Identification results of both agro-infiltration method and R gene specific primers PCR amplification were not consistent in some potato genotypes,reflecting that both methods have some defects.The desirable resultscouldbeobtainedbycombiningthetwomethods.

potato;late blight;avirulence gene;resistant gene;transient expression;agro-infiltration

S532

A

1672－3635（2014）04-0217-08

2014-07-02

國家“863”項目（2013AA102603）；國家自然科學基金項目（31171603）；華中農業大學2013年大學生科技創新基金（SRF 2013222）。

周晶（1991-），女，碩士研究生，研究方向為馬鈴薯抗病分子生物學。

田振東，教授，從事馬鈴薯分子生物學研究，E-mail:tianzhd@mail.hzau.edu.cn。