血小板黏附受體GPIb-IX-V介導的信號通路研究進展

胡 萍綜述 謝如鋒，王志成審校

血小板黏附受體GPIb-IX-V介導的信號通路研究進展

胡 萍1，2綜述 謝如鋒2，王志成3審校

血小板在生理性止血和病理性血栓形成中起關鍵作用。血小板黏附受體GPIb-IX-V復合物能與血管性血友病因子（VWF）、P-選擇素、凝血酶等結合，在血小板血栓形成的起始階段和凝血過程中起重要作用。磷脂酶C（PLC）、磷脂酶A2（PLA2）、14-3-3ζ蛋白、細胞骨架等參與GPIb-IX-V介導的信號通路，現就GPIb-IX-V復合物介導的信號通路作一綜述。

血小板；糖蛋白；信號通路；血栓；止血

當血管內皮細胞受到損傷（如：動脈粥樣硬化斑塊破裂），或在病理性血流高剪切力作用下，血小板通過其表面糖蛋白（glycoprotein，GP）Ib-IX-V復合物中的GPIbα的膜外功能區，與血管內皮表面或血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）結合，這種結合使得血小板以滾動方式黏附在損傷血管表面［1］；同時，GPIbα與VWF結合啟動血小板信號轉導途徑，血小板內發生Ca2＋濃度升高、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等蛋白激酶活化、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）釋放等一系列反應，導致血小板表面另一受體整合素αIIb/β3的活化，活化的αIIb/β3與血漿中纖維蛋白原和VWF結合，最終導致血小板相互聚集成團，形成血小板血栓［1－2］。因此，GPIb-IX-V介導的信號通路在血小板血栓形成過程中起關鍵作用。

1 GPIb-IX-V結構

GPIb-IX-V復合物由4個跨膜亞單位組成：GPIbα通過二硫鍵與GPIbβ按1∶1比例形成GPIb，GPIb與GPIX以1∶1的比例通過非共價鍵組成GPIb-IX復合物。GPIb-IX復合物對于配體結合和信號轉導是有效的。糖蛋白V（glycoprotein V，GPV）以1∶2的比例與GPIb-IX通過松散的方式構成GPIb-IX-V復合物［3］，見圖1。

1.1 GPIbαGPIbα是GPIb-IX-V復合物中最大、也是最重要的1個亞基，由610個氨基酸殘基組成，分子量為135 ku［3］。GPIbα基因定位在17號染色體短臂。GPIbα含有多個結構域，從N端開始：1－282，含有多個GPIb-IX-V配體的結合位點；283－302，由富含帶負電荷氨基酸殘基組成，包括天冬氨酸、谷氨酸以及3個硫酸化的酪氨酸殘基；303－485，由高度糖基化、黏蛋白樣的聚糖多肽構成；486－514為跨膜域；515－610為胞質尾［3］。GPIbα胞質尾含有細胞內蛋白或信號分子（例如：14-3-3ζ）結合位點。其中GPIbα 559、587/590、609位氨基酸殘基為絲氨酸，磷酸化后能與信號蛋白14-3-3蛋白結合［4－5］。550－570位氨基酸殘基含有肌動蛋白結合蛋白（actin binding protein，ABP）的結合位點，通過ABP將GPIb-IX-V復合物錨定在細胞膜骨架上，這種結合對于調節VWF誘導的血小板黏附和活化非常重要［6］。

1.2 GPIbβGPIbβ由181個氨基酸殘基組成，分子量為25 ku。GPIbβ基因定位在22號染色體長臂。GPIbβ通過位于膜外附近的二硫鍵與GPIbα連接，通過15－32位氨基酸殘基與GPIX非共價鍵相連［7］。胞質尾由34個氨基酸殘基組成，含有鈣調蛋白結合位點（149－167），其中166位是絲氨酸殘基，能被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）磷酸化，磷酸化絲氨酸能與14-3-3蛋白結合［1］。Maurer et al［8］使用抗GPIbβ胞外域的單克隆抗體RAM.1減少血小板黏附、GPIb介導的信號、凝血酶產生和動脈血栓形成，表明GPIbβ在GPIb介導的信號通路中起重要作用。

1.3 GPIXGPIX由160個氨基酸殘基組成，分子量22 ku。GPIX基因定位在3號染色體長臂。胞質尾非常短，只有5個氨基酸殘基組成，在細胞膜內側附近含有1個被十六烷酰化的半胱氨酸殘基，十六烷酰化修飾可能為錨定GPIb-IX-V到細胞膜提供另外一個機制［9］。

1.4 GPVGPV由544個氨基酸殘基組成，分子量為82 ku。GPV基因定位在3號染色體長臂。GPV通過直接與GPIbα相互作用，連接2個GPIb-IX復合物。胞質尾由16個氨基酸殘基組成，含有14-3-3蛋白和鈣調蛋白結合位點［3］。在高剪切力條件下，GPV對于加強GPIb-IX-V復合物與VWF結合起關鍵作用［10］，見圖1。

2 GPIb-IX-V介導的信號通路

VWF結合GPIb-IX-V能啟動血小板內細胞轉導途徑，引起脫顆粒、胞內Ca2＋濃度增加、細胞骨架重排和“從內向外”活化整合素αIIb/β3，活化的αIIb/β3與VWF或纖維蛋白原結合，引起血小板聚集成團，形成血小板血栓［3］。GPIb-IX-V復合物介導的信號通路主要涉及以下幾條通路，見圖2。

圖1 GPIb-IX-V結構示意圖

圖2 GPIb-IX-V介導的主要信號通路示意圖

2.1 活化免疫受體酪氨酸基礎的活化模序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITAM）含有的受體在理解VWF與GPIb-IX-V結合誘導的跨膜信號研究中，重大發現之一是發現兩個ITAM含有的受體FcγRIIA和FcR-γ鏈酪氨酸殘基的磷酸化。FcγRIIA是IgG低親和力受體，分子量為40 ku的跨膜蛋白，其細胞外域含有兩個IgG樣結構域，細胞內域含有一個ITAM模序。聚集的免疫球蛋白能誘導FcγRIIA成簇并活化FcγRIIA，涉及肝素關聯的血小板減少癥［11］。FcR-γ鏈是Fc受體（如：FcεRI、FcγRI和FcγRIII）必需的1個亞基，也含有ITAM模序。在血小板中，FcR-γ鏈主要與GPVI連接構成膠原受體［12］。通常，當受體與配體結合后，ITAM模序內的2個酪氨酸殘基發生磷酸化，通過與SH2域結合招募并活化Syk酪氨酸激酶，啟動細胞內酪氨酸激酶基礎的信號通路［13］。在完整的血小板中，VWF與GPIb-IX-V結合誘導快速的FcγRIIA酪氨酸磷酸化［13］。這個事件不是由血小板產生的血栓素A2（thromboxane A2，TxA2）介導，而是由Src激酶介導，因為Src激酶特異性抑制劑PP1能阻止這個過程［13］。使用熒光能量轉移和酵母雙雜交實驗都證實GPIb-IX-V與FcγRIIA是相互結合在一起的［3］。GPIb-IX-V與FcγRIIA的結合發生在特異的脂筏區域［9］。VWF與GPIb-IX-V結合也能誘導Syk激酶介導的FcR-γ鏈酪氨酸磷酸化。VWF刺激誘導的FcR-γ鏈酪氨酸磷酸化是快速的、短暫的，最大在15～60 s，5 min內減少。PP1抑制劑能阻止FcR-γ鏈酪氨酸磷酸化以及與Syk的連接，表明這些事件是關聯的，同時也證實Src家族在這個事件中起重要作用［14］。

2.2 Src家族酪氨酸激酶與GPIb-IX-V信號通路

通過研究鈣離子動員和磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2）研究發現，酪氨酸磷酸化信號事件涉及GPIb-IX-V介導的血小板活化。早在1994年，研究GPIb-IX-V介導的血小板活化時發現Src與細胞骨架連接，同時有多個蛋白酪氨酸磷酸化［15］。隨后的研究［8］顯示，VWF與GPIb-IX-V結合，能誘導酪氨酸激酶Syk和接頭蛋白shc的酪氨酸殘基磷酸化。Wu et al［14］使用VWF和botrocetin一起處理血小板，發現GPIb-IX-V介導的血小板活化能誘導FcR-γ鏈，Syk，LAT和PLCγ2的酪氨酸磷酸化。Src激酶抑制劑能顯著地抑制上述蛋白的酪氨酸磷酸化事件，同時，VWF與GPIb-IX-V相互作用能誘導Src、Lyn、FcR-γ鏈和Syk形成復合物，表明Src激酶在這個過程中的重要作用［16］。VWF和瑞斯托霉素誘導的血小板活化，FcRIIA在Syk和PLCγ2活化之后也發生酪氨酸磷酸化，Src激酶抑制劑PP1能顯著抑制這些事件［16］。在GPIb-IX-V介導的信號通路，Src是其最鄰近的下游信號分子之一［16］。磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI-3K）激酶p85調節亞單位組成性與GPIb-IX-V結合，PI-3K抑制劑不影響該結合［3］。在VWF結合GPIb-IX-V誘導的血小板活化，Src通過其SH3域與連接在GPIb上的PI-3K的p85亞單位結合［16］。已證實Src激酶和它的下游信號分子PLCγ2參與許多血小板反應，包括在VWF包被的表面血小板Ca2＋動員和鋪展［2］。最近Delaney et al［17］使用血小板Rac1-/-小鼠和Rac1抑制劑，發現Lyn-Vav-Rac1-PI3K-Akt信號通路在介導VWF/GPIb-IX引起的整合素αIIb/β3活化中起重要作用。

2.3 磷脂酶C（phospholipase C，PLC）與GPIb-IX-V信號通路許多研究已證實VWF結合GPIb-IX-V誘導PLC活化。Kroll et al［18］研究發現，用VWF和瑞斯托霉素處理血小板引起細胞內Ca2＋濃度升高和PKC介導的pleckstrin磷酸化，這兩個事件都被PLC衍生的第二信使三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酯酰甘油（diacylglycerol，DAG）所調節。同時有研究［13］顯示，這兩個事件能被環氧化酶抑制劑indomethacin阻止，表明在GPIb-IX-V信號通路PLC活化位于磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）下游，需要TxA2的產生。TxA2結合血小板表面偶聯有Gq蛋白的7次跨膜受體，活化PLCβ亞家族，主要是PLCβ2［19］。然而，由GPIb-IX-V介導的信號通路主要涉及PLCγ2而不是PLCβ2。PLCγ2活化受到酪氨酸磷酸化和PI-3K的脂質產物的調節［20］。已證實VWF與GPIb-IX-V結合能促進PLCγ2酪氨酸磷酸化，這個事件受到ITAM含有受體FcγRIIA和FcR-γ鏈的調節［13］。另外，抑制PI-3K可顯著抑制GPIb-IX-V誘導的PLC活化［13］。

2.4 PLA2與GPIb-IX-V信號通路已有研究［13］證實，TxA2參與VWF誘導的血小板活化，特別是VWF誘導的PLC活化、Ca2＋動員、pleckstrin磷酸化和顆粒分泌，需要PLA2活化和隨后TxA2的產生，所有這些事件能被阻止花生四烯酸轉化為TxA2的環氧化酶抑制劑所阻斷。但是，由VWF結合GPIb-IX-V復合物所引起的其他一些事件，如某些蛋白的酪氨酸磷酸化卻不依賴TxA2的產生［13］。這些研究表明VWF結合GPIb-IX-V引起血小板活化通過TxA2依賴的和TxA2非依賴的信號通路。在VWF刺激血小板產生TxA2依賴的PLA2活化，主要是85 ku的胞質PLA2（cPLA2）［2］。胞質內Ca2＋濃度升高和絲氨酸殘基磷酸化都能活化cPLA2。在VWF與GPIb-IX-V結合誘導的cPLA2活化，可能主要是通過p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）介導的505位絲氨酸殘基磷酸化［8］。最近Estevez et al［21］使用LIMK-/-小鼠研究發現，LIMK-/-的血小板選擇性損傷VWF/GPIb-IX誘導的cPLA2的磷酸化和隨后的TxA2產生，提示LIMK1在GPIb-IX介導的TxA2合成和血栓形成中起重要作用。

2.5 14-3-3ζ與GPIb-IX-V信號通路14-3-3蛋白家族是細胞內接頭蛋白，由異二聚體或同二聚體組成，含有兩個配體結合位點，廣泛參與細胞內信號轉導［3］。人的血小板有5個14-3-3亞型，ε和η亞型弱表達，γ、ζ和β亞型高表達［22］。最初在純化GPIb-IX-V時首次發現14-3-3ζ與GPIb-IX-V結合，隨后的研究［23］發現GPIbα C端最后5個氨基酸殘基（605-610）SGHpSL610包含609磷酸化絲氨酸對于14-3-3ζ與GPIb-IX結合非常重要，刪除或封閉C端14-3-3ζ結合位點引起14-3-3ζ與GPIb-IX分離，同時抑制VWF與GPIb-IX的結合［23－24］。GPIb-IX第2個14-3-3ζ結合位點位于GPIbβ胞質域，其中166絲氨酸殘基對于結合14-3-3ζ非常關鍵［3］。在靜息血小板609位絲氨酸殘基組成性磷酸化［23］，而166位絲氨酸殘基磷酸化受到PKA的動態調節［25］。PKA通過磷酸化166位絲氨酸殘基負性調節VWF與GPIb-IX的結合［33］。另外，Mangin et al［5］研究發現在GPIbα 580-590位氨基酸序列也能結合14-3-3ζ，其中587和590位絲氨酸的磷酸化在與14-3-3ζ結合中非常關鍵，該結合位點在調節整合素依賴的血小板鋪展具有重要作用。Yuan et al［4］發現，在GPIbα 551－564位氨基酸序列也能結合14-3-3ζ，其中559位絲氨酸殘基磷酸化非常關鍵。

2.6 GPIb-IX-V與細胞骨架血小板骨架組成收縮裝置調節血小板形狀改變和鋪展，而且，細胞骨架參與形成細胞內信號網絡，能連接和組裝許多信號分子。許多研究已證實，配體與GPIb-IX-V結合能誘導細胞骨架重排，幾個信號蛋白重新分布到新形成的肌動蛋白網絡［1］。而且，有證據［3］表明，細胞骨架參與調節配體與GPIb-IX-V的結合。在高剪切力作用下，GPIb與VWF相互作用刺激纖維狀肌動蛋白組裝到GPIb-IX-V復合物［26］。VWF與GPIb-IX-V相互作用能誘導形成由細絲蛋白、肌動蛋白和GPIb-IX-V構成的復合物［8］。Feng et al［6］發現，ABP結合到GPIbα對于細胞骨架重排、血小板聚集和一些信號蛋白酪氨酸磷酸化是必需的。通過肌動蛋白結合蛋白將GPIbα結合到細胞膜骨架可能負性調節VWF與GPIbα的結合［27］。

2.7 PI-3K與GPIb-IX-V信號通路PI-3K的調節亞單位p85與GPIb-IX-V復合物結合，能介導Src結合到GPIb［16］。血小板黏附到固定的VWF能誘導PI-3K活化，或在瑞斯托霉素誘導下，可溶性VWF和GPIb-IX-V結合也能誘導PI-3K活化［3］。在高剪切力條件下，PI-3K與酪氨酸激酶Syk連接，而且，已證實在VWF刺激的血小板，PI-3K通過p85調節亞單位與GPIb-IX-V和Src形成復合物［16］。PI-3K活性狀態不影響PI-3K與Src結合形成復合物，因為特異性PI-3K抑制劑wortmammin不抑制復合物的形成［16］。有研究［28］顯示，GPIb-IX-V介導的Src和PLCγ2活化以及Ca2＋升高不受PI-3K活性的影響，但血小板聚集和鋪展在VWF表面則依賴PI-3K的活性。但是，PI-3K在通過GPIb-IX-V引起血小板活化中的具體作用目前還不是很清楚。

2.8 環鳥苷一磷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）依賴的蛋白激酶之前通常被接受的觀點是提高血小板胞質內cGMP濃度和cGMP依賴的蛋白激酶（protein kinase G，PKG）活性抑制血小板活化［29］。然而，最近的研究［30］表明，cGMPPKG信號通路在GPIb-IX-V介導的血小板活化中扮演重要的刺激作用。在細胞模型中，表達重組PKG提高VWF誘導的整合素αIIb/β3活化。

3 結語

GPIb-IX-V是血小板表面含量多的膜蛋白之一，在血小板血栓形成的起始和凝血過程中起關鍵作用。雖然GPIb-IX-V相關聯的信號通路還沒有完全闡明，但是越來越多的證據表明Src家族激酶和PLCγ2相關聯的信號在GPIb-IX-V介導的血小板活化過程中發揮重要作用。在高剪切力條件下，GPIb-IX-V與整合素αIIb/β3之間對話對于血小板血栓形成起重要作用，但該對話所涉及的機制還需要深入研究。

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R 558；R 331.1＋43；R 34

A

1000－1492（2014）03－0419－05

2013－07－08接收

上海市教委科技創新項目（編號：12YZ068）；上海市自然科學基金（編號：12ZR1429900）

1華東師范大學生命科學學院，上海 200241

2上海市血液中心血液工程研究室，上海 200051

3上海市中醫醫院實驗中心，上海 200071

胡 萍，女，碩士研究生；謝如鋒，女，主任技師，責任作者，E-mail：rufeng33＠hotmail.com；王志成，男，助理研究員，責任作者，E-mail：ahwzc＠126.com