嬰兒巨細胞病毒性肝炎外周血Treg及IL-l7表達水平與肝損傷的關聯性

孫曉紅，梁曉君，周會祥，冷耀明，王敏

(九江學院附屬醫院檢驗科，江西九江332000)

嬰兒巨細胞病毒性肝炎外周血Treg及IL-l7表達水平與肝損傷的關聯性

孫曉紅，梁曉君，周會祥，冷耀明，王敏

(九江學院附屬醫院檢驗科，江西九江332000)

目的探討嬰兒巨細胞病毒性肝炎(CMV)外周血調節性T細胞(Treg)及白介素17(IL-17)表達水平與肝臟損傷的關聯性。方法43例CMV肝炎患兒根據其肝損傷程度分為輕癥組31例、重癥組12例，32例健康小兒作為正常對照組。采用流式細胞術檢測外周血Treg細胞百分比，ELISA法檢測血清IL-17的表達水平，熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測尿HCMVDNA載量，并同時測定血清膽紅素、丙氨酸轉移酶水平，分析它們之間的關聯性。結果43例CMV肝炎組外周血Treg細胞百分比顯著低于正常對照組(P＜0.01)，其中重癥組外周血Treg細胞百分比也顯著低于輕癥組(P＜0.01)；而CMV肝炎組血清IL-17表達水平則顯著高于正常對照組(P＜0.01)，重癥組血清IL-17水平也顯著高于輕癥組(P＜0.01)；尿HCMV-DNA載量在CMV肝炎各組中差異無統計學意義(P＞0.05)。相關分析顯示，外周血Treg細胞百分比與IL-17呈負相關(r=-0.590，P＜0.01)，而血清IL-17水平與血清總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平呈正相關(r分別為：0.749，0.785，P＜0.01)。結論外周血Treg細胞及IL-17表達失衡可能在嬰兒巨細胞病毒性肝炎發病機制中發揮重要作用，且與肝損傷嚴重程度密切相關。

嬰兒；巨細胞病毒性肝炎；Treg；IL-17；TBIL；ALT

嬰兒巨細胞病毒性肝炎(infant cytomegalovirus hepatitis，ICH)是指在嬰兒時期由于先天或圍生期或生后感染人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，CMV)后引起的一類感染性疾病，是由遺傳、機體免疫和環境因素共同作用所致，以黃疸、肝脾腫大、肝功能損害為主要臨床表現。巨細胞病毒可通過直接損害宿主細胞和免疫損傷引起肝細胞病變，CMV肝炎是其主要臨床發病類型之一，常見于年幼和抵抗力弱的兒童，尤其是嬰兒期[1]，占嬰兒肝炎綜合征的50%。本文通過檢測CMV肝炎患兒外周血Treg細胞百分比、血清IL-17表達水平及尿人巨細胞病毒(HCMV-DNA)載量，探討其與肝損傷指標血清血清膽紅素、丙氨酸轉移酶水平的相關性，從而進一步闡明Treg細胞、細胞因子IL-17介導的嬰兒巨細胞病毒性肝炎的發病機制，為該病的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 對象選擇2010年2月至2013年4月我院門診和住院就診的CMV肝炎患兒36例，其中男20例，女16例，年齡1～3歲，診斷標準采用1998年11月中華醫學會兒科分會感染消化學組制定的《巨細胞病毒感染診斷方案》[2]，經PCR-DNA定量檢測確診為CMV病毒感染，均為初發未經抗病毒及免疫抑制劑治療病例。根據臨床及B超排除膽道閉鎖排除膽道系統畸形、其他病毒性肝炎(如甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝、EB病毒、風疹病毒、單純皰疹病毒感染所致的肝炎)及代謝和藥物性肝炎等。CMV肝炎組中31例血清總膽紅素＜170μmol/L、ALT＜200U/L者劃為輕癥組，12例血清總膽紅素≥170μmol/L和或ALT≥200U/L者劃為重癥組[3]。正常對照組選擇同期在本院健康體檢兒童32例，男18例，女14例，年齡1～3歲，經檢測肝炎病毒抗體系列：HAV-IgM，乙肝表面抗原(HB-sAg)，丙肝抗體(IgG)，丁肝抗原(HDV-Ag)；戊肝抗體(IgM)，庚肝抗體(IgG)及PCR-CMVDNA均陰性，肝功能正常。隨機選取試驗對象，使受試者在年齡、性別構成上差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。受試者家屬已知情同意本實驗，且通過醫院學術倫理委員會批準。

1.2 儀器和試劑本研究所用試劑：美國BD公司生產的FITC-CD4抗體、APC-CD25抗體、PEFoxp3抗體；美國R&D公司生產的人IL-17檢測試劑盒；中山大學達安基因診斷公司生產的尿CMV-DNA試劑盒。所用儀器：FACSCantoⅡ流式細胞儀(美國BD公司)，2010酶標儀(丹麥Bio-Cell公司)，ABI 7500 FQ-PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 外周血Treg細胞百分率檢測全部對象均空腹采集EDTA抗凝血2ml,用淋巴細胞分離后,取白霧層洗滌離心，沉淀后PBS重懸，配成每個流式管內1×106個細胞，再分別加入相應的熒光標記抗體(FITC-CD4、APC-CD25)，避光孵育30min。用透化液洗滌2次后PBS重懸。再加入抗人Foxp3+抗體，避光孵育30min。透化液洗滌細胞2次，按標準操作規程上機檢測，分析Treg細胞平均熒光強度。計算CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分率。

1.2.2 血清IL-17水平檢測清晨采用普通管抽取實驗對象外周血2ml,3000r/min離心10min，吸取上清標本分裝于EP管中,置-80OC冰箱凍存。采用雙抗體夾心法法測定血清IL-17水平，嚴格按試劑盒使用說明操作。每樣本設3個復孔，酶測試儀450nm處讀數。

1.2.3 尿CMV-DNA檢測尿CMV-DNA檢測采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)。取中段清晨尿液2ml，800g離心10min，取沉淀物檢測DNA。使用廠家提供的配套軟件，并嚴格按照試劑說明書操作，每次檢測均帶室內質控，與樣本反應管上機檢測。93℃2min預變性進入循環，93℃30s55℃45s擴增40個循環，電腦計算尿CMV-DNA含量。陽性：每毫升尿CMV-DNA載量大于103拷貝。

1.2.4 統計學分析采用SPSS17.0統計學軟件。計量資料以x±s表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson分析法。以P＜0.05視為具有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血Treg細胞的百分比、血清IL-17水平、尿CMV-DNA含量及血清TBIL、ALT水平CMV肝炎組外周血Treg細胞百分比顯著低于正常對照組(P＜0.01)，重癥組外周血Treg細胞百分比也顯著低于輕癥組(P＜0.01)；而CMV肝炎組血清IL-17表達水平則顯著高于正常對照組(P＜0.01),重癥組血清IL-17水平也顯著高于輕癥組(P＜0.01)；CMV肝炎組血清TBIL、ALT水平顯著高于正常對照組(P＜0.01)；尿HCMV-DNA載量在CMV肝炎各組中差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組外周血Foxp3+Treg、IL-17水平、尿CMV-DNA載量、血清TBIL、ALT水平的比較

2.2 相關性分析外周血Treg細胞百分比與IL-17呈負相關(r=-0.590，P＜0.01)，而血清IL-17水平與血清TBIL、ALT水平呈正相關(r分別為：0.749，0.785，P＜0.01)。

3 討論

巨細胞病毒具有典型的皰疹病毒形態。在自然人群中感染普遍多為隱性，對免疫系統尚未發育完善的嬰兒表現為顯性感染，若不及早治療對嬰兒危害性很大。日本學者Yasumi等首先提出IL-17是一種肝臟嚴重性急性損傷的新標志[4]。在肝細胞損害及病毒清除過程中，病毒、機體免疫狀態決定了嬰兒CMV的持續感染[5]。IL-17是一種前炎癥因子，被認為是Thl7細胞產生的最主要的可以標志其亞群的細胞因子，是T細胞誘導的炎癥反應早期啟動因素，在多種肝病的發病及抗病毒免疫中均有表達[6]。具有較強的炎癥介導功能。而Thl7細胞與Treg細胞在分化過程及免疫效應方面存在相互抑制、相互拮抗的效應[7]。CMV最易侵犯管道上皮細胞，尤其是腎臟及肝膽系統[8]，上皮細胞、內皮細胞極易受CMV感染，肝臟作為病毒侵入嬰幼兒機體的重要靶器官，CMV感染嬰幼兒肝臟及膽管上皮細胞后，經提呈抗原和白細胞粘附，催化產生多種細胞和基因參與免疫、炎癥的反應，導致肝臟感染進一步加重[9]。Treg是機體負向調節外來抗原免疫應答的重要細胞亞群，是T淋巴細胞中表達CD4+CD25+Foxp3+的一類T細胞亞型，通過細胞直接接觸以及分泌細胞因子IL-10和TGF-β等多種方式來抑制機體對外來物質的有效性、保護性免疫應答。Beriou等研究證實Treg細胞在高水平IL-1與IL-6的體系中可變為分泌IL-17的Foxp3+IL-17細胞，同時失去抑制活性，說明Treg細胞與Thl7細胞的可塑性可能參與了疾病過程[10]。CD4+CD25+Foxp3+是Treg細胞表型標記。其最特異性的轉錄因子Foxp3+，通過直接與Thl7細胞轉錄因子ROR結合，抑制ROR介導IL-17A mRNA的轉錄，影響Thl7細胞的功能[11]，促進Foxp3+對Treg細胞分化成熟和功能的發揮[12]。

為了解感染CMV致肝炎患兒炎癥因子分泌水平及T輔助細胞功能狀況，以及其與肝功能損害程度的相關性,筆者選擇Treg細胞、IL-17、TBIL、ALT水平作為檢測指標。結果顯示CMV肝炎組Foxp3+Treg顯著低于對照組，IL-17水平顯著高于對照組，Treg細胞百分比及IL-17含量能夠反應機體細胞免疫狀況，由此可判斷CMV患兒細胞免疫功能異常，細胞免疫狀態下降。因此，機體細胞免疫應答狀態的改變與CMV患兒的感染密切相關。在肝功能的各項常規檢測中，ALT是反映肝細胞損害最敏感的指標，TBIL反映肝臟合成與代謝狀態。本研究結果顯示，CMV感染患兒ALT、TBIL平均值比正常顯著高于正常對照組。提示作為患兒肝細胞損傷的診斷指標，可早期發現癥狀性嬰幼兒CMV肝炎并積極治療。

采用熒光定量PCR檢測技術進行HCMVDNA定量檢測，其靈敏度高，已成為臨床檢測診斷CMV感染的重要手段，可提供病毒在患兒體內存在的直接證據。尿HCMV-DNA水平及其水平的高低可以判斷患兒是否感染CMV以及鑒別診斷潛伏性CMV感染和活動性CMV感染[13]。本研究通過熒光定量PCR檢測嬰兒尿液HCMV-DNA含量，發現CMV肝炎組尿液HCMV-DNA平均含量顯著高于正常對照組，因而在CMV肝炎患兒活動性感染的早期診斷和療效監測方面具有廣闊的應用前景。

綜上所述，嬰兒巨細胞病毒性肝炎其HCMVDNA載量與HCMV疾病嚴重程度，病毒播散及細胞免疫功能紊亂有很大的相關性。提示在病情治療過程中，檢測患兒的免疫狀態以及病毒感染等實驗指標，對患兒的病情監測及后續治療提供了可靠的實驗依據。

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R512.6，R446.62

A

1674-1129(2014)05-0528-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.05.013

2014-03-24；

2014-07-11)

孫曉紅，女，1971年出生，主管技師，學士學位，主要從事免疫學和微生物學檢驗。

梁曉君，女，1985年出生，檢驗師，學士學位，主要從事免疫學檢驗和臨床基礎檢驗。