孕婦外周血胎兒ε血紅蛋白基因mRNA的表達及與孕齡的相關(guān)性

劉紅英，楊利麗，楊和軍，劉順梅，張金寶

近年來，隨著人們對于遺傳疾病危害的認識逐漸加深，產(chǎn)前診斷越來越受到關(guān)注。由于傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法對于孕婦及胎兒均存在一定的傷害，因此，無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷成為近年來眾多學(xué)者的研究熱點之一[1]。母血中胎兒特異性RNA的發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究開辟了新的篇章[2]。本研究通過對孕婦外周血胎兒ε血紅蛋白基因mRNA的定量分析，闡述ε血紅蛋白基因mRNA的濃度與孕齡之間的關(guān)系，從而為進一步臨床診斷方案的選擇提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年10月—2009年11月在濰坊市人民醫(yī)院行產(chǎn)前檢查的7～16周正常單胎妊娠孕婦30例為研究對象，年齡25～37歲；第一次妊娠9例，多次妊娠21例。均無內(nèi)外科疾病和吸煙史，均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和處理 取孕婦空腹肘靜脈血5 ml，置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝的試管中，5 ml全血加入10 ml 異硫氰酸胍裂解液，快速而徹底的勻漿，并分裝到1.5 ml的離心管中，每管裝1 ml全血異硫氰酸胍裂解液。

1.2.2 全血RNA的提取和檢測 常規(guī)方法提取孕婦全血RNA，紫外分光光度計檢測吸光度，判斷RNA的濃度和純度是否符合要求。

1.2.3 胎兒ε血紅蛋白基因mRNA表達水平檢測 使用AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成，總反應(yīng)體系20 μl，其中RNA 5 μl，5倍反應(yīng)緩沖液4 μl，Rnase inhibitor(20 U/μl) 1 μl，dNTP mix(10 mmol/L) 2 μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(10 U/L) 2 μl，逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后產(chǎn)物于-70 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增胎兒血紅蛋白ε基因，上游引物5′-TTTTACTGCTGAGGAGAAGGCTGCC-3′，下游引物5′-CTTGCCAAAGTGAGTAGCCAGAATAA-3′。以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物如下：上游引物5′-TGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3′，下游引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′。PCR循環(huán)周期條件：變性94 ℃ 60 s，退火57 ℃ 120 s，延伸72 ℃ 120 s，共35個循環(huán)，然后72 ℃ 延伸 8 min，于 4 ℃ 條件下終止反應(yīng)。

1.2.4 對胎兒血紅蛋白基因ε序列擴增產(chǎn)物的定量分析 利用凝膠成像系統(tǒng)對血紅蛋白基因ε序列擴增產(chǎn)物陽性樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，利用ImageJ軟件對每條電泳條帶進行圖像分析，測定電泳條帶的灰度值。計算孕婦外周血中ε血紅蛋白基因mRNA 的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用Spearman秩相關(guān)分析研究外周血中ε血紅蛋白基因mRNA濃度與孕齡之間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦外周血總RNA的質(zhì)量濃度及純度測定 30例樣品RNA質(zhì)量濃度值為0.98～3.19 g/L，平均(1.87±0.76)g/L；光密度平均比值為1.79，所提全血總RNA具有較高的質(zhì)量濃度及純度(見圖1)。

2.2 胎兒ε血紅蛋白基因mRNA的體外擴增結(jié)果 樣品的凝膠電泳圖像見圖2，30例樣品中，7例陽性，23例陰性。根據(jù)電泳條帶灰度值，計算血紅蛋白基因ε序列mRNA的表達濃度(見表1)。孕婦外周血中胎兒ε血紅蛋白基因mRNA 濃度為0.537～1.790 μg/ml，中位數(shù)為1.241 μg/ml。孕婦外周血中胎兒ε血紅蛋白基因mRNA的濃度與孕齡呈負相關(guān)(r=-0.750，P=0.026，見圖3)。

注：泳道1～5均為孕婦外周血RNA樣本

圖1 血液總RNA電泳條帶

Figure1 Electrophoresis result of whole-RNA extracted from maternal blood

注：泳道1為DNA marker(100～1 000 bp)，泳道2～6為ε血紅蛋白基因mRNA RT-PCR產(chǎn)物，長度為355 bp，泳道7為GAPDH mRNA 標(biāo)準(zhǔn)品RT-PCR產(chǎn)物，長度為222 bp，泳道8為空白對照

圖2 胎兒ε血紅蛋白基因mRNA RT-PCR電泳圖

Figure2 Electrophoresis result of ε hemoglobin gene mRNA after RT-PCR

3 討論

圖3 孕婦外周血中ε血紅蛋白基因mRNA的濃度與孕齡的相關(guān)性

Figure3 The concentration of ε hemoglobin gene mRNA in different pregnant woman′s blood

表1 胎兒ε血紅蛋白基因mRNA凝膠成像結(jié)果

無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷一直是近幾年來醫(yī)學(xué)工作者的研究重點之一，母血中胎兒遺傳物質(zhì)的識別和收集正是這項研究的靶點[3]。研究報道發(fā)現(xiàn)人們已經(jīng)陸續(xù)從母血中分離到了胎兒的有核紅細胞[4]和胎兒DNA[5]，為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的實施奠定了基礎(chǔ)。但由于有核紅細胞和胎兒DNA存在分離困難、龐大母體背景影響等缺點[6]，因此，母血中胎兒RNA的分離應(yīng)用備受關(guān)注。本研究著重探討了從母血中分離收集胎兒ε血紅蛋白基因mRNA的方法，并分析了其表達水平與孕齡的關(guān)系，為臨床無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的具體實施提供了理論依據(jù)。

在胚胎發(fā)育早期，胎兒體內(nèi)的血紅蛋白主要有Hb Gower1(ζ2ε 2)和Hb Gower2(α2ε2)兩種類型；到胚胎發(fā)育第8周后，則以HbF(α2γ2)為主；出生后至成人期則以HbA(α2β2)為主[7]。從上述血紅蛋白出現(xiàn)的不同時間及其不同的分子式可以看出，血紅蛋白的各種基因表達時間和表達豐度會隨著胚胎的發(fā)育不斷的發(fā)生變化。因此，本研究選擇孕7～16周的早孕婦女為研究對象，從母血中分離胎兒ε血紅蛋白基因mRNA，并探討其與孕齡的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕婦外周血中確實存在胎兒ε血紅蛋白基因mRNA，而且其含量在孕7～10周與孕齡呈負相關(guān)。此結(jié)果與國內(nèi)外學(xué)者研究基本一致[8]。

本研究選擇的30例標(biāo)本中只有7 例陽性，其余23 例均為陰性，分析原因發(fā)現(xiàn)，23 例陰性者大都為10～16周的孕婦，故提示在臨床應(yīng)用母血中胎兒ε血紅蛋白基因mRNA做產(chǎn)前診斷時，應(yīng)選擇在孕7～10周進行，且由于其含量與孕齡呈負相關(guān)，因此越早越好。

綜上所述，與胎兒有核紅細胞和胎兒DNA相比，胎兒mRNA具有分離容易、不受母體背景影響等優(yōu)點，因此胎兒mRNA用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷具有切實的可行性，雖然存在含量微少等實際缺陷[9]，但仍為臨床診斷方案的具體實施提供了廣闊的前景。

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