廣西扶綏肝細胞癌家系XRCC1基因Arg194Trp多態性與肝細胞癌遺傳易患性關系的病例對照研究

丁 飛，謝裕安

原發性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發病率約為歐美地區的10倍，病死率位列我國惡性腫瘤第二位。因其起病隱匿，早期可無任何癥狀，發現時病情已多為中、晚期，導致治療和預后均較差。我國原發性肝癌中，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占90%。目前已證實人群HBV/HCV感染、黃曲霉素毒B1(aflatoxin B1，AFB1)的攝入、飲水污染等與HCC的發生密切相關，而遺傳易患性導致的個體HCC發病風險的不同也日益受到關注。

DNA分子作為遺傳的物質基礎，其結構和功能的完整性對于維持機體的正常生理功能和遺傳穩定性至關重要。如果細胞DNA損傷反應機制發生異常，將會導致個體的癌癥易患性顯著增加。XRCC1(X-ray cross complementing group 1)是一種重要的DNA修復基因，其編碼的蛋白質在堿基切除修復(base excision repair，BER)和DNA單鏈斷裂修復的過程中起重要作用。因此，目前認為XRCC1的多態性可能改變DNA修復的功能和效率，使環境因素致癌的風險增加。目前對XRCC1的單核苷酸多態性研究最多的3個位點分別位于第6、9、10外顯子中，依次為C26304T、G27466A和G28152A，分別導致相應氨基酸殘基的改變(Arg194Trp、Arg280His和Arg194Trp)[1]。大量的臨床流行病學資料顯示，上述3個位點的基因多態性與個體發生某些腫瘤的危險性有關。其中，在對XRCC1基因多態性與HCC易患性的研究方面，大多集中在399位點，而對194位點的研究較少。因此，為進一步探討XRCC1基因Arg194Trp多態性與HCC遺傳易患性之間的關系，本研究選取我國HCC高發地區之一的廣西扶綏縣HCC家系人群與當地正常家系人群進行病例對照研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用病例對照研究方法，于2003年1月—2011年5月在廣西扶綏縣采集21個HCC家系(HCC家系組，76例)，于2011年1—5月在與HCC家系相同的自然村采集20個對照家系(對照組，76例)。HCC家系組年齡16～86歲，平均(45.6±14.8)歲；男42例，女34例；HBsAg陽性48例，HBsAg陰性28例；甲胎蛋白(AFP)陽性13例，陰性63例；吸煙(≥1包/d)6例，不吸煙(<1包/d)70例；飲酒(≥250 g/d)6例，不飲酒(<250 g/d)70例。對照組年齡16～85歲，平均(48.0±16.6)歲；男56例，女20例；HBsAg、AFP均陰性；吸煙34例，不吸煙42例；飲酒34例，不飲酒42例。HCC家系由HCC患者(A組，21例)及與其有血緣關系的直系親屬(B組，55例)共同組成，其中HCC患者為廣西醫科大學附屬腫瘤醫院進行外科手術的扶綏縣患者，術后經組織病理學診斷為HCC，術前未經放射、化學或生物治療，且經病史采集提示其直系親屬中至少已有1人確診HCC。對照家系(C組)與HCC家系無血緣關系，且其家庭結構、成員數與HCC家系相似，體檢結果均正常，無肝炎病史、腫瘤病史、腫瘤家族史。

1.2 方法 本研究采取匹配設計，通過嚴格選擇受檢者，經不同人員對具體信息進行核實和檢查以及對潛在的混淆因素進行校正來控制偏倚。然后檢測各組受檢者XRCC1 Arg194Trp基因型。

1.2.1 DNA提取 按照天根生化科技(北京)有限公司生產的試劑盒說明，從手術切除的癌組織標本或外周血標本中提取XRCC1的基因組DNA。

1.2.2 XRCC1 Arg194Trp基因型分析 以限制性片段長度多態性聚合酶鏈式反應(PCR-RFLP)方法進行XRCC1基因Arg194Trp多態性分析。參照文獻[2]設計引物序列：上游引物5′-GCCCCGTCCCAGGTA-3′，下游引物5′-AGCCCCAAGACCCTTTCACT-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應體系：1 μl模板DNA，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，加雙蒸水(ddH2O)到反應體系為25 μl。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、59 ℃復性30 s、72 ℃延伸30 s(進行30個循環)，72 ℃最后延伸5 min。

RFLP酶切反應體系：10×Buffer 1 μl、PCR產物6.5 μl、10 μg/μl小牛血清(BSA)0.1 μl、10 U/μl PvuⅡ內切酶0.8 μl、滅菌去離子水1.6 μl，總反應體系為10 μl。放入37 ℃恒溫儀溫育4 h。酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，于Thermo熒光成像儀下觀察結果。同時，PCR產物送測序(上海英駿生物技術有限公司)。

結果判斷：XRCC1密碼子194位點存在野生型Arg和突變型Trp兩種等位基因，野生型純合子Arg/Arg(CC基因型)不能被限制性內切酶PvuⅡ酶切，只有一個長491 bp的片段；突變型純合子Trp/Trp(TT基因型)能完全被限制性內切酶PvuⅡ酶切，產生分別為197 bp和294 bp的兩個片段；突變型雜合子Arg/Trp(CT基因型)酶切后則產生分別為197、294、491 bp的3個片段。

1.3 統計學方法 根據Hardy-Weinberg遺傳平衡定律進行吻合度檢驗。采用SPSS 17.0軟件包進行統計分析。以比值比(OR)及95%可信區間(CI)表示各種基因型與發生HCC風險之間的相關性。OR值以非條件Logistic回歸法計算，所有統計采用雙側概率檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 酶切結果 XRCC1基因Arg194Trp多態性的各基因型通過凝膠電泳分析鑒定并經測序證實：圖1為Arg194Trp的PCR擴增的目的片段(491 bp)；圖2為Arg194Trp的PCR產物的RFLP分析；圖3～5為不同基因型的PCR擴增產物的DNA測序分析結果。

注：M為Marker 2，1～10為PCR產物(491 bp)
圖1 XRCC1基因Arg194Trp PCR擴增目的片段
Figure1 PCR amplification of XRCC1 gene C26304T site Arg194Trp

注：M為Marker DL2000，第2、5、12泳道為CT基因型，第4、6泳道為TT基因型，其他泳道均為CC基因型
圖2 XRCC1基因Arg194Trp PCR-RFLP分析
Figure2 Genotyping of XRCC1 gent C26304T site Arg194Trp polymorphism by PCR-RFLP analysis

圖3 XRCC1基因194位點DNA測序分析(CC基因型)Figure 3 DNA sequencing of XRCC1 gene site 194(CC genotype)

圖4 XRCC1基因194位點DNA測序分析(TT基因型)Figure 4 DNA sequencing of XRCC1 gene site 194(TT genotype)

圖5 XRCC1基因194位點DNA測序分析(CT基因型)Figure 5 DNA sequencing of XRCC1 gene site 194(CT genotype)

2.2 XRCC1基因194位點基因型吻合度檢驗 經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，各組人群中XRCC1 Arg194Trp等位基因型頻率與期望值吻合度較好(A組：χ2=1.80，P=0.18；B組：χ2=1.51，P=0.22；C組：χ2=1.70，P=0.19)，符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡，表明具有良好的代表性。

2.3 XRCC1 Arg194Trp基因型分布及等位基因分布 3組受檢者中XRCC1基因194位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中A組基因型分布及等位基因頻率與C組比較，差異有統計學意義〔P<0.012 5(α′)，見表1〕。

2.4 XRCC1基因194位點基因多態性與HCC的關系 采用非條件Logistic回歸分析，對性別、年齡、吸煙和飲酒4個因素進行校正，結果發現B組CT、TT基因型個體發生HCC的風險分別是CC基因型個體的0.473倍和0.426倍。C組CT、TT基因型個體發生HCC的風險分別是CC基因型個體的0.206倍和0.240倍?？梢?，CT、TT基因型個體發生HCC的風險可能較CC基因型個體減低，但差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

3 討論

腫瘤的發生、發展是一個多基因、多細胞、多階段的過程，與個體遺傳和外部環境的作用關系密切。由于外部環境損傷機體主要是通過DNA發揮作用，因此，DNA損傷后是否能夠得到及時、準確的修復對于防止細胞癌變至關重要。BER是DNA損傷后最主要的修復機制之一，涉及切除損傷堿基和核心BER反應兩個重要過程，由多種蛋白參與，其中XRCC1起重要作用[3]。XRCC1自身不具有催化酶的活性，但其編碼的蛋白與DNA聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ、多聚ADP核糖聚合酶(PARP)結合形成復合體，發揮重要的支架蛋白作用，參與BER和DNA單鏈斷裂修復[4-5]。目前研究已發現XRCC1基因的多態性與食管癌、胃癌、結腸癌、肺癌等多種腫瘤的發生存在相關性，如Xing等[6]對XRCC1基因194位點的研究發現攜帶TT基因型者比攜帶CC、CT基因型者發生鱗狀細胞食管癌的危險性增加；Hung等[7]研究發現，CC基因型個體與肺癌風險無相關性。在對XRCC1基因多態性與HCC易患性的研究方面，Kiran等[8]在印度人群中進行的研究結果顯示，Arg194Trp、Arg280His基因多態性會增加患肝炎相關HCC的風險，當Arg280His與Arg194Trp或Arg399Gln聯合作用時患肝炎相關HCC的風險將顯著提高。

本研究選取我國HCC高發地區之一的廣西扶綏縣HCC家系人群為研究對象。研究結果顯示，HCC家系中未患HCC者CT基因型個體發生HCC的風險是CC基因型個體的0.473倍〔95%CI(0.117，1.914)〕；TT基因型個體發生HCC的風險是CC基因型個體的0.426倍〔95%CI(0.064，2.858)〕。對照家系中CT基因型個體發生HCC的風險是CC基因型的0.206倍〔95%CI(0.035，1.201)〕；TT基因型個體發生HCC的風險是CC基因型個體的0.240倍〔95%CI(0.027，2.168)〕。無論是對照家系還是HCC家系人群中，CT基因型和TT基因型的個體較CC基因型發生HCC的風險差異無統計學意義，故結果僅提示T等位基因可能會減低HCC的發生。

HCC的發生是遺傳因素和環境因素共同作用的結果，其中作為分子遺傳學基礎的遺傳因素可以改變個體對環境中致HCC因素的易患性。對于XRCC1基因Arg194Trp多態在不同人群、不同地區的研究結果出現的分歧，可能與其遺傳背景、生活地域、習慣及環境中接觸的致癌物不同有關。

表1 3組受檢者中XRCC1 Arg194Trp基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 1 Comparison of genotype distribution and allele frequency of XRCC1 Arg194Trp

注：C組基因型與A組比較，χ2=12.091，P=0.002；C組等位基因頻率與A組比較，χ2=8.294，P=0.004

表2 XRCC1 Arg194Trp基因型與HCC患病風險的關系〔n(%)〕Table 2 Association between XRCC1 Arg194Trp genotype and HCC

注：ref代表參照，即以CC基因型作為參照；-無數據；*表示B組與A組比較，△表示C組與A組比較

綜上所述，本研究尚未發現XRCC1基因Arg194Trp多態性與HCC發病具有相關性，但提示CT基因型和TT基因型的個體患HCC的風險可能較CC基因型的個體減低。本研究未得到預期的陽性結果的主要原因，可能與收集到的樣本量不夠大有關。如果在今后的研究中加大HCC家系人群樣本量的收集，繼續上述研究可能會得到預期的陽性結果。另外，本研究結果對于進一步研究扶綏縣乃至其他地區HCC高危人群的發病風險提供了分子遺傳學的依據，并對HCC的預防具有一定的參考意義。

1 Shen MR，Jones IM，Mohrenweiser H.Nonconservative amino acid substitution variants exist at polymorphic frequency in DNA repair genes in healthy humans[J].Cancer Res，1998，58(4)：604-608.

2 吳昊.廣西扶綏人群XRCC1、Caspase9基因單核苷酸多態性與肝細胞癌遺傳易感性研究[D].南寧：廣西醫科大學，2009.

3 Wood RD，Mitchell M，Sgouros J，et al.Human DNA repair genes[J].Science，2001，291(5507)：1284-1289.

4 Caldecott KW，Aoufouchi S，Johnson P，et al.XRCC1 polypeptide interacts with DNA polymerase beta and possibly poly(ADP-ribose) polymerase，and DNA ligase Ⅲ is a novel molecular ′nick-sensor′ in vitro[J].Nucleic Acids Res，1996，24(22)：4387-4394.

5 李文駿，向華，馬慶波.DNA修復基因XRCC1的194位點多態性與晚期非小細胞肺癌鉑類化療敏感性關系的Meta分析[J].中國全科醫學，2011，14(7)：2417.

6 Xing D，Qi J，Miao X，et al.Polymorphisms of DNA repair genes XRCC1 and XPD and their associations with risk of esophageal squamous cell carcinoma in a Chinese population[J].Int J Cancer，2002，100(5)：600-605.

7 Hung RJ，Brennau P，Canzian F，et al.Large-scale investigation of base excision repair genetic polymorphisms and lung cancer risk in a multicenter study[J].J Nat Cancer Inst，2005，97(8)：567-576.

8 Kiran M，Saxena R，Chawla YK，et al.Polymorphism of DNA repair gene XRCC1 and hepatitis-related hepatocellular carcinoma risk in Indian population[J].Mol Cell Biochem，2009，327(1/2)：7-13.